莱斯顿型埃博拉病毒GP蛋白嵌合型水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究

摘要

埃博拉出血热(EHF)是由埃博拉病毒(EBOV)引起的一种感染人和非人类灵长类动物急性出血性传染病。EBOV属于丝状病毒科埃博拉病毒属成员，为单股不分节段的负链RNA病毒。糖蛋白（GP）是EBOV诱导机体产生保护性中和抗体的关键蛋白也是表面唯一的跨膜蛋白。目前已知的EBOV共有五种，从1976年到2014年已经造成数次大规模的流行。在五种埃博拉病毒中，扎伊尔型埃博拉病毒（ZEBOV）的毒力最强，在人和非人类灵长类动物上，感染性和致死率高达90％以上，而莱斯顿型埃博拉病毒（REBOV）的毒力较弱，可引起食蟹猴发病和死亡，也可感染人但不出现明显症状，无致病力。1989年间，从菲律宾进口到美国的一批医用食蟹猴体内首次检测出了REBOV。2008年在菲律宾的猪场中，又再次检测到了REBOV，同时猪伴随有蓝耳病病毒共同感染。然而到目前为止尚未有可用的疫苗，因此，安全、有效的莱斯顿型埃博拉病毒疫苗的研发具有重要意义。
　　水泡性口炎病毒（VSV）作为有囊膜单股负链不分节段RNA病毒的复制和装配机制研究的重要模型病毒，应用范围广泛。VSV基因组长约11kb，从3'端至5'端依次编码N、 P、 M、 G和L共5种蛋白，最长可容纳4.5kb的外源片段，且插入的外源片段高度稳定，具有较高的表达效率。
　　本研究利用RNA病毒反向遗传操作技术，以重组病毒rVSV-EGFP为载体，用REBOV GP基因替换VSV G基因，构建并拯救了嵌合病毒rVSV?G*EGFP-REBOV-GP。通过激光共聚焦检测和western blot试验证明了REBOV GP蛋白在嵌合病毒中获得正确表达。嵌合病毒生长动力学结果显示，在细胞培养过程中，rVSV?G*EGFP-REBOV-GP与亲本株rVSV-EGFP具有不同的生长特性。将rVSV?G*EGFP-REBOV-GP以5×106TCID50/0.1mL的高剂量肌肉注射接种小鼠，连续观察两周并且每日称重，结果表明接种小鼠无一发病，体重增长趋势与PBS对照组一致，说明嵌合病毒对小鼠不具致病性。将rVSV?G*EGFP-REBOV-GP以1×106TCID50/0.1mL的剂量免疫小鼠后，分别于一免和二免后采集静脉血，分离血清并进行中和试验检测，结果表明该嵌合病毒能诱导小鼠产生针对 REBOV GP的高滴度中和抗体，说明嵌合病毒对小鼠具有良好的免疫原性。因此，本实验为制备安全、有效的REBOV储备性疫苗奠定了基础。

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第一章 引 言

1.1 埃博拉病毒概述

1.1.1 埃博拉病毒的一般特性

1.1.2 莱斯顿型埃博拉病毒简介

1.1.3 莱斯顿型埃博拉病毒的流行病学

1.1.4 莱斯顿型埃博拉病毒的分子结构

1.1.5 莱斯顿型埃博拉病毒的致病力

1.1.6 莱斯顿型埃博拉病毒GP的结构与功能

1.2.水泡性口炎病毒

1.2.1 水泡性口炎病毒概述

1.2.2 水泡性口炎的症状和流行病学

1.2.3 水泡性口炎病毒的基因结构和生物学特性

1.2.4 水泡性口炎病毒研究进展

1.3 国外研究进展

1.4 研究的目的与意义

第二章 实验部分

2.1 材料

2.1.1 病毒、细胞和质粒

2.1.2 实验动物与高免血清

2.1.3 主要试剂和仪器

2.2 方法

2.2.1莱斯顿型埃博拉病毒GP基因的扩增及嵌合病毒基因组的构建

2.2.2 嵌合病毒的拯救

2.2.3 嵌合病毒的鉴定

2.2.4 免疫试验

2.3 结果

2.3.1 GP基因的扩增及嵌合病毒基因组全长cDNA的构建和嵌合病毒的拯救

2.3.2 RT-PCR鉴定

2.3.3 GP蛋白表达的western blot检测

2.3.4 GP蛋白的激光共聚焦检测

2.3.5嵌合病毒的生长动力学

2.3.6嵌合病毒对小鼠的安全性

2.3.7免疫试验

第三章 讨论

第四章 全文结论

参考文献

附录

致谢

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