基于触角转录组的麦长管蚜OBPs和CSPs基因鉴定及表达谱研究

摘要

麦长管蚜Sitobion avenae(Fabricius)是世界性禾谷类作物的主要害虫，不仅直接取食小麦植株汁液，而且是植物病毒的传毒媒介，严重影响小麦的品质和产量。目前生产上防治技术主要以化学防治为主，产生了多重的负面影响，如残留，抗药性，环境污染等问题。因此，绿色防控技术研发与应用受到广泛的重视，其中利用植物或蚜虫报警外激素等挥发物的驱避害虫及引诱天敌的推拉技术成为研究热点。
　　触角是昆虫主要感知挥发物的器官，对于昆虫触角感器特别是化学感受器的研究是昆虫化学生态学的生理基础；而对参与嗅觉识别过程的嗅觉相关蛋白的研究，对解析昆虫对气味物质识别的分子机制具有重要的意义，其中在嗅觉识别起始过程中起重要作用的嗅觉相关蛋白包括气味结合蛋白（Odorant binding proteins, OBPs）和化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）。但是目前麦长管蚜触角感器及嗅觉相关蛋白尚没有系统研究。因此，本文采用扫描电镜，对麦长管蚜有翅无翅成蚜及各龄期若蚜触角的超显微结构进行观察；对有翅和无翅孤雌成虫触角进行转录组测序，鉴定其OBPs和CSPs；利用实时荧光定量PCR技术（qPCR）对鉴定的OBPs和CSPs表达谱进行分析。取得如下主要研究结果：
　　对麦长管蚜各龄若蚜及有翅无翅成蚜触角感器超的微结构观察结果表明：成蚜主要触角感器包括5种感器，即原生感觉圈、次生感觉圈、毛形感器、钟形感器和单个腔锥形感器，其中，原生感觉圈主要由板形感器和腔锥形感器组成，毛形感器存在typeⅠ和typeⅡ两种类型。有翅和无翅成蚜间各类型感器在种类和分布相对一致，但数量上存在差异，有翅成蚜次生感觉圈有7-13个，无翅成蚜有1-5个。而若蚜的观察结果显示，各龄若蚜在触角感器的种类和分布上均没有差异，但是在触角的节数上有明显不同，1龄和2龄若蚜触角为5节，从3龄开始触角为6节。与成虫相比，各龄若蚜没有次生感觉圈，具橛感器等感器。
　　以麦长管蚜有翅和无翅成虫触角 RNA为模板，构建了两个非均一化的有翅无翅触角文库，采用二代高通量（Illumiuna RNA-seq）测序平台，对有翅无翅成虫触角 cDNA文库进行测序，得到133,331个 unigenes，平均长度为594 bp，转录本147,665个，平均长度为652bp。之后将得到的转录本在七大数据库（Nr, Nt, Pfam, KOG/COG, Swiss-prot, KEGG和GO数据库）中的注释情况进行统计。利用注释信息及tBLASTx技术，注释并鉴定得到12个典型OBPs，1个Plus-C OBP和5个CSPs，其中6个OBPs和3个CSPs为麦长管蚜中首次发现。从信号肽预测、保守结构域和构建系统进化树对序列进行了分析。
　　利用 qPCR技术，对上述鉴定的 OBPs和 CSPs基因进行不同龄期及不同组织的表达谱分析：不同龄期若蚜包括1龄、2龄、3龄有翅、3龄无翅、4龄有翅、4龄无翅，成蚜期包括有翅和无翅，不同组织包括有翅与无翅成虫的触角，无触角的头，胸，腹和足。结果显示，蚜虫SaveOBPs和 SaveCSPs基因表达量在不同组织及不同发育阶段存在明显差异。在对有翅无翅成蚜各组织的相对定量的分析中发现，7个 OBPs（SaveOBP6、SaveOBP7、SaveOBP9、SaveOBP10、 SaveOBP13、SaveOBP14和 SaveOBP15）和1个CSP（SaveCSP1）在触角中高表达，推测这些基因在蚜虫嗅觉识别中可能具有重要的作用。除在触角中，SaveOBP8, SaveCSP2和 SaveCSP5在有翅或无翅成蚜的足中高表达；SaveOBP2还主要在有翅无翅成蚜头中表达；SaveOBP1在头，胸和腹中的表达量显著高于在触角和足中的表达量， SaveOBP3, SaveOBP4, SaveCSP3和 SaveCSP4在全身各组织中均有表达。在不同组织及不同发育阶段中 OBPs和 CSPs表现出了复杂的表达分布特性，受不同发育阶段所调控，在调控蚜虫行为中可能行驶了多种不同的职责。这些结果都将对后续麦长管蚜 SaveOBPs和 SaveCSPs功能研究提供了重要的理论基础。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1昆虫触角感受器研究进展

1.2昆虫气味结合蛋白的研究进展

1.3昆虫化学感受蛋白的研究进展

1.4麦长管蚜嗅觉分子机理研究现状及存在问题

1.5研究目的和意义

1.6研究内容

第二章 麦长管蚜触角超显微结构观察

2.1试验材料

2.2试验方法

2.3结果与分析

2.4结论与讨论

第三章 麦长管蚜有翅和无翅成蚜触角转录组测序及嗅觉相关基因鉴定

3.1试验材料

3.2试验方法

3.3结果与分析

3.4结论与讨论

第四章 麦长管蚜嗅觉相关基因OBPs和CSPs表达谱分析

4.1试验材料

4.2试验方法

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章 结 论

参考文献

致谢

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