羊传染性脓疱病毒VIR蛋白对宿主细胞p53和IFN-α的调控

摘要

羊传染性脓疱病毒（orf virus, ORFV）属于痘病毒科，副痘病毒属，可引起一种接触性人兽共患传染病。ORFV主要感染山羊和绵羊，临床上主要表现为嘴唇、鼻、口腔黏膜出现丘疹、水疱、脓疱和结节。该病发病率高，死亡率相对较低，若继发其他病原感染则死亡率升高。人感染后主要表现为手背、指间和前臂出现疱疹和破溃。该病在世界范围内广泛流行，严重制约养羊业的健康发展，同时也威胁相关从业人员的身体健康。
　　ORFV自身编码一系列拮抗宿主免疫应答的蛋白，导致感染后虽能引起宿主强烈的免疫反应，却能够反复感染同一宿主。VIR是ORFV编码的免疫调节蛋白之一，具有拮抗干扰素（interferon, IFN）的活性，目前其作用机制尚不清楚。p53是细胞内的一种多功能蛋白，在抗病毒先天性免疫方面发挥重要作用。研究表明p53能够抑制许多病毒的复制，且与I型IFN通路有重要的联系。VIR对宿主细胞p53以及IFN-α是否具有调控作用是本文主要研究目的，为此本文做了以下研究：
　　1. VIR蛋白对宿主细胞IFN-α的调控
　　为研究VIR蛋白对IFN-α表达的影响，本研究以山羊成纤维上皮细胞（GSFs）为对象，使用仙台病毒（SeV）单独刺激、SeV与VIR共同刺激GSFs，使用定量ELISA方法检测GSFs上清中IFN-α的浓度，结果显示VIR蛋白对SeV刺激的IFN-α表达和分泌有明显的抑制作用。
　　2. VIR蛋白对宿主细胞p53的调控
　　首先检测了ORFV感染细胞后p53表达水平的变化，结果显示在ORFV感染早期对p53的表达有抑制作用。将构建的VIR的真核表达载体，转染至细胞中，研究VIR对p53表达的影响，结果显示VIR在BHK-21细胞中表达后，p53 mRNA水平和蛋白水平明显降低。表明ORFV对p53的抑制作用与VIR蛋白有关。
　　3. ORFV感染过程中p53对IFN-α下游干扰素刺激基因（ISGs）表达的调控
　　建立了基于VIR基因的SYBR GREEN法检测ORFV拷贝数的方法，检测了p53表达受到抑制后，ORFV在羊皮肤成纤维细胞中的复制水平，绘制p53抑制组和p53正常对照组ORFV的生长曲线，结果表明抑制p53表达后ORFV在宿主细胞内的复制水平升高。本研究还证实抑制p53表达时，IFN-α刺激或ORFV感染后，干扰素刺激基因IRF7，IRF9，ISG15，ISG20，GBP1，OAS1的表达量相对于p53正常对照组表达量明显降低。构建p53的真核表达载体转染至BHK-21细胞中，荧光定量 PCR检测 ISGs的表达量，结果表明 IRF7，IRF9，ISG15，ISG20，GBP1，OAS1基因的表达量升高。将VIR质粒、p53质粒共转染至细胞中后，细胞的IRF7，IRF9，ISG15，ISG20， GBP1，OAS1基因的转录水平相比只转染p53质粒组明显降低，表明VIR能够抑制p53对ISGs转录水平的诱导。
　　全文研究结果证实ORFV编码的VIR蛋白能抑制宿主p53基因转录水平和蛋白水平的表达；VIR蛋白能够抑制宿主细胞IFN-α及其下游基因IRF7，IRF9，ISG15，ISG20，GBP1，OAS1。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1羊传染性脓疱病毒研究进展

1.2 VIR研究进展

1.3 p53与I型干扰素

1.4 研究目的及意义

第二章 VIR蛋白对宿主细胞IFN-α的调控

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4讨论

第三章VIR蛋白对宿主细胞p53的调控

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 ORFV感染过程中p53对IFN-α下游ISGs表达的调控

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历