鸽Ⅰ型副粘病毒Pi/CH/LHLJ/110822弱毒株拯救及免疫效力初步评价

摘要

鸽新城疫（Newcastle disease,ND）是严重危害养鸽业的病毒性传染病，其病原为鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus typeⅠ, PPMV-1），又称为鸽新城疫病毒。在新城疫病毒（NDV）的基因分型中，PPMV-1虽然与目前常规疫苗毒株同处于classⅡ系中，但PPMV-1在系统进化发育树上形成了一个独立分支-基因Ⅵb型，而传统疫苗毒株属于基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，与基因Ⅵb型抗原性差异较大，导致现有疫苗免疫鸽后保护效果不佳。反向遗传学操作技术可以对病毒基因组进行突变、缺失或外源基因插入修饰等，从而快速获得毒力致弱毒株，可用于研制基因Ⅵb型的鸽新城疫专用疫苗。
　　鸽 I型副黏病毒 Pi/CH/LHLJ/110822（Pi110822）为2011年分离自黑龙江省（ICPI=1.19， MDT=63h），是我国目前鸽中流行毒株。Pi110822毒株基因组DNA已经完整地克隆至pUC18载体，基因组10176nt位置构建了遗传标记（NheI酶切位点）。本研究在此基础之上，将pUC18中的基因组通过In-Fusion技术亚克隆至pOLTV5载体中，构建了含有Pi110822全长基因组cDNA的质粒pOLTV5-0822FL，与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞，拯救出了新城疫病毒r0822。鉴定结果表明，拯救病毒遗传标记存在，毒力、在鸡胚成纤维细胞和鸡胚上的生长特性与亲本毒相近，从而成功构建了Pi110822毒株的反向遗传操作平台。
　　研究表明，新城疫病毒的F蛋白裂解位点的氨基酸组成是其毒力主要决定因素。依据这一特点，将pOLTV5-0822FL质粒中病毒基因组进行改造，分别构建了F蛋白裂解位点突变为疫苗株LaSota相应序列的重组质粒，以及Pi110822的F基因替换为LaSota F基因的重组质粒，并成功拯救出F蛋白裂解位点突变毒株（Pi110822-FCS）和F基因替换毒株（Pi110822-LAF）。鉴定结果表明， Pi110822-FCS毒株与Pi110822-LAF毒株的ICPI值均由亲本毒的1.19降低为0，MDT由63h增加为大于168h，表明两株拯救病毒的毒力降低，由中等毒力毒株变为弱毒株。Pi110822-FCS与Pi110822-LAF分别感染的第5、10、15、20代的鸡胚尿囊液测定HA效价，然后进行RT-PCR扩增测序，结果表明突变位点经20代连续传代仍稳定存在，具有遗传稳定性。
　　为筛选免疫原性良好的鸽新城疫弱毒疫苗株，对两株弱毒株的安全性和免疫原性进行了初步评估。安全性评价试验结果表明，2株病毒的尿囊液原液免疫3日龄SPF鸡后，在观察的15天内未出现发病和死亡，安全性良好。由于鸽新城疫病毒（Ⅵ型）对鸡均为中等毒力或低毒力毒株，所以选用基因Ⅶ型强毒株 NDV/HLJ/01/06株攻毒免疫的 SPF鸡，Pi110822-FCS组发病率为72.72％(8/11)，死亡率为54.54%(6/11)，Pi110822-LAF组发病率为50%(5/10)，死亡率为20%(2/10)，对照组全部死亡。攻毒毒株为基因Ⅶ型，与免疫毒株（基因Ⅵ型）抗原性差异较大，仍能起部分交叉保护作用。将Pi110822-FCS灭活后免疫20日龄SPF鸡，两周抗体HI效价能达到7.5±1.12，三周时HI效价达到9.1±1，表明作为灭活苗可在鸡体内刺激产生高水平血清抗体。
　　本研究还进行了 Pi110822-FCS在鸽上的免疫保护试验，但由于鸽未完成净化，本身携带新城疫病毒，导致试验数据无法使用。以上实验结果综合分析表明，本研究所拯救的2株PPMV-1弱毒株，可以作为鸽用疫苗候选株继续研究。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1 鸽新城疫

1.2新城疫病毒反向遗传操作应用情况

1.3 本研究的目的和意义

第二章 PPMV-Ⅰ反向遗传操作平台的建立

2.1实验材料

2.2 实验方法

2. 3 实验结果

2.4 讨论

第三章 Pi110822弱毒株的拯救与鉴定

3.1实验材料

3. 2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 鸽新城疫病毒弱毒株免疫效果初步评价

4.1实验材料

4. 2 实验方法

4. 3 实验结果

4.4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

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