菠菜高密度遗传图谱构建及性别决定基因X/Y的精细定位

摘要

菠菜（Spinacia oleracea L.），黎科菠菜属二倍体植株(2n=12)，是以绿叶为主要产品的重要蔬菜作物。菠菜是典型的雌雄异株植物，少量植株表现为两性株，其雌雄性别受X/Y基因的控制，是研究雌雄异株植物性别决定及分化机制的一种理想材料。目前国内外已构建的菠菜遗传图谱分子标记数量较少且不便于使用，缺乏高密度遗传图谱，且菠菜性别决定基因尚未精细定位及克隆，性别调控机制仍不明确。因此，本研究利用特异位点扩增片段测序(SLAF-seq)技术结合HighMap软件构建了菠菜高密度遗传图，并通过SRAP-BSA及super-BSA对菠菜性别决定基因XY进行了精细定位，借助基因注释获得了一些菠菜激素调控和开花相关的候选基因。主要研究结果汇总如下:
　　1、利用SLAF-seq技术结合HighMap构建了菠菜高密度遗传图。该图谱包含4080个SLAF标记，共划分为6个连锁群，总图距为1，125.97cM，相邻标记间的平均图距为0.31cM，这是目前研究中密度最高的菠菜遗传图谱。
　　2、利用SRAP-BSA法对菠菜性别决定基因X/Y进行初步定位，通过雌雄基因池对1280个SRAP引物组合进行筛选，其中20个引物组合与性别基因紧密连锁。结合前人研究相关标记，利用含148个单株的BC1群体构建了一个15.9cM的菠菜性别区域连锁图，平均图距为0.72 cM，将性别决定基因定位在一个0.4 cM的区间内。
　　3、利用super-BSA法对性别决定基因X/Y进行精细定位。通过50个雌性单株和50个雄性单株测序数据混池寻找菠菜性剐性状关联区域。最终有323个SLAF标记与菠菜性别决定基因紧密连锁，结合菠菜高密度遗传图谱，将菠菜性别决定区域定位在LG4连锁群66.98cM-69.72cM和75.48cM-92.96cM两个区间内。
　　4、整合SLAF及SRAP等性别连锁标记，构建了一个16.7cM的性别区域连锁遗传图，将菠菜性别决定基因X/Y定位在0.2cM区间内。通过性别区域连锁遗传图，辅助菠菜基因组组装，将scaffold锚定在相应性别连锁标记上，对定位区域的基因进行了功能注释，得到166个基因位于目标性状的定位区域内，根据注释信息得到了32个基因与花发育或者激素调控网络相关。
　　5、将SRAP27.47及SRAP30.39转化为稳定性高、特异性好的SCAR标记，将dCAPs标记D4.3转化为可高通量基因分型的KASP标记，应用于苗期雌雄株性别快速鉴定，经过143个雌雄单株的验证，该KASP标记准确率可达到100％。

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摘要

图目录

表目录

英文缩略表

第一章 引言

1．1 雌雄异株植物性别决定机制研究进展

1．1．1 遗传因素与性别决定

1．1．2 环境因素与性别决定

1．2 菠菜性别决定研究进展

1．2．1 菠菜雌雄株花器官形态特征

1．2．2 菠菜性别遗传规律及细胞遗传学研究进展

1．2．3 菠菜性别决定分子水平研究进展

1．2．4 菠菜参考基因组研究进展

1．3 分子标记类型

1．3．1 基于凝胶电泳检测的基因分型技术

1．3．2 基于荧光信号检测的基因分型技术

1．3．3 基于高通量测序技术的基因分型技术

1．4 本研究目的意义

1．5 本研究的主要内容及技术路线

1．5．1 研究内容

1．5．2 技术路线

第二章 菠菜高密度遗传图谱构建

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 电子酶切预测最佳酶切位点

2．1．3 SLAF-seq分子标签开发

2．1．4 高密度遗传图谱构建

2．2 结果与分析

2．2．1 基因组DNA提取及质量检测

2．2．2 测序数据统计与质量评估

2．2．3 SLAF标签开发

2．2．4 菠菜高密度遗传图谱构建

2．3 本章小结及讨论

第三章 SRAP-BSA法对菠菜性别决定基因的初步定位

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 酶、试剂及试剂盒

3．1．3 SRAP-BSA筛选性别连锁标记

3．1．4 菠菜性别决定基因初步定位

3．1．5 SRAP标记PCR产物切胶回收及测序

3．1．6 SCAR标记的转化

3．2 结果与分析

3．2．1 菠菜性别遗传分析

3．2．2 SRAP连锁标记的筛选

3．2．3 SRAP-BSA法构建菠菜性别区域连锁遗传图

3．2．4 SCAR标记辅助选择育种

3．3 本章小结及讨论

第四章 菠菜性别决定基因精细定位

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 super-BSA法对菠菜性别决定基因的快速定位

4．1．3 菠菜性别区域连锁遗传图的构建

4．1．4 候选区域基因注释

4．1．5 KASP基因分型技术

4．2 结果与分析

4．2．1 super-BSA法对菠菜性别决定基因的快速定位

4．2．2 菠菜性别决定基因的精细定位

4．2．3 候选基因的筛选

4．2．4 KAsP辅助选择育种

4．3 本章小结及讨论

4．3．2 菠菜性染色体与甜菜参考基因组共线性分析

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历