禽致病性大肠杆菌ptsI的调控作用研究

摘要

禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）是养禽业最常见的致病菌之一，可感染鸡、鸭、火鸡和其他禽类，可引起禽类严重的呼吸道和全身性感染，对养禽业造成重大损失。APEC严重的耐药性和复杂的血清型，严重制约该病的防控。
　　密度感应(Qurom Sensing，QS)是细菌通过自身产生小分子自诱导物来协调群体行为的过程。LuxS/AI-2型密度感应系统广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌中，它通过小分子自诱导物AI-2来调节细菌的许多生理功能。信号分子AI-2发挥其调控作用，需要借助AI-2受体和相关的转运蛋白将其由胞外转运至胞内。本实验室前期研究表明，大肠杆菌MG1655可以通过lsrB基因内化AI-2，但不同于大肠杆菌MG1655，禽致病性大肠杆菌DE17（O2血清型）也可以内化AI-2，但不存在lsrB样基因，因此推测DE17可能存在不同于lsrB基因的其他基因参与APEC对AI-2的内化。经生物信息分析，本研究选取可能参与AI-2内化的磷酸烯醇丙酮酸盐磷酸转移系统(PTS)中的ptsⅠ(phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase)基因和ABC操纵子中的1633(riboseABC transporter permease)基因，并开展了ptsⅠ和1633对AI-2内化、APEC致病性以及生物被膜形成的影响研究，以期为从群体感应角度开展禽致病性大肠杆菌防控提供参考。
　　1.禽致病性大肠杆菌ptsⅠ缺失株的构建及其对AI-2内化的影响
　　利用red重组技术构建APEC的ptsⅠ缺失株DE17ΔptsⅠ和1633缺失株DE17Δ1633，运用报告菌株哈维弧菌BB170对野生株DE17和缺失株DE17ΔptsⅠ、DE17Δ1633进行AI-2内化动力学检测，结果表明与野生株DE17相比DE17ΔptsⅠ对AI-2的内化提前4h，而DE17Δ1633基因缺失后与野生株相比没有差异。
　　为了验证PtsⅠ是否具有AI-2结合活性，本研究构建了pET28a-PtsⅠ表达载体，在大肠杆菌BL21ΔluxS(DE3)宿主菌中，以可溶性方式表达了大小为63.5 KD的PtsⅠ重组蛋白。在浓度为1mg/ml的重组蛋白PtsⅠ中，加入终浓度为33μM的AI-2，37℃孵育1h后检测PtsⅠ与AI-2的结合与释放，结果表明重组蛋白PtsⅠ并不能结合AI-2。本研究表明PTS系统中的ptsⅠ基因可能参与AI-2的内化，但不具有AI-2结合活性。
　　2.ptsⅠ基因对禽致病性大肠杆菌致病性的调控作用
　　对缺失株DE17ΔptsⅠ与野生株DE17的生物学特性分析表明，ptsⅠ基因缺失不影响其生长特性;对7日龄樱桃谷鸭攻毒统计各菌株半数致死量，结果表明野生株DE17的LD50值为1.24×103CFU，而缺失株DE17ΔptsⅠ的LD50值为2.21×104 CFU，与野生株DE17相比，缺失株DE17ΔptsⅠ的毒力下降了约17.8倍。
　　分别用野生株、缺失株以2.0×106 CFU的剂量对7日龄樱桃谷鸭进行攻毒，24 h后统计细菌在血液和脏器中的载菌量，结果表明:肝脏中的载菌量野生株DE17(4.5×108 CFU/g)是缺失株DE17ΔptsⅠ(3.3×104 CFU/g)的13600倍(P＜0.05);脾脏中的载菌量野生株DE17(2.4×108 CFU/g)是缺失株DE17ΔptsⅠ（3.5×106 CFU/g）的68倍(P＜0.05);肾脏中的载菌量野生株DE17(3.8×108 CFU/g)是缺失株DE17ΔptsⅠ(2.9×106 CFU/g)131倍(P＜0.05)，而1 mL血液中的载菌量野生株DE17(2.5×108 CFU/ml)是缺失株DE17ΔptsⅠ(6.9×104 CFU/ml)的362倍(P＜0.05)。
　　对7日龄樱桃谷鸭以2.0×106 CFU的剂量分别用野生、缺失株进行攻毒，24h后解剖，取其肝、脾、肾制作病理切片，野生株DE17病变明显，局部心肌细胞条索状坏死，肝细胞空泡变性，脾脏淋巴细胞减少，肾小管部分上皮细胞水肿;相比于野生株DE17，缺失株DE17ΔptsⅠ在心肌细胞中、肝细胞、脾脏组织和肾小管部分的病变程度都较轻。
　　对DF-1细胞的粘附入侵实验结果表明，缺失株DE17ΔptsⅠ的黏附能力是（6.9×106CFU/孔）野生株DE17的黏附能力（3.4×104 CFU/孔）2倍(P＜0.05)，但野生株DE17(4.5×104 CFU/孔)与缺失株DE17ΔptsⅠ（4.0×104 CFU/孔）对DF-1细胞的入侵能力无明显差异。
　　本研究结果表明，ptsⅠ基因对禽致病性大肠杆菌致病性的具有调控作用。
　　3.ptsⅠ基因对生物被膜的调控作用
　　细菌生物被膜(Biofilm)是细菌粘附于物质表面，并通过胞外基质包裹具有严密结构性的多细胞群体形态，细菌生物被膜形成与其致病性和运动性相关。本研究开展了ptsⅠ和1633基因的缺失对APEC生物被膜形成影响研究。结果表明，缺失株DE17ΔptsⅠ与野生株DE17相比生物被膜形成能力显著下降(P＜0.0001)，缺失株DE17Δ1633与野生株DE17相比生物被膜形成能力没有差异。在刚果红半固体平板上验证运动性变化，实验结果显示缺失株DE17ΔptsⅠ和DE17Δ1633与野生株DE17相比运动性下降(P＜0.05)。观察ptsⅠ缺失后对细菌形态的变化，结果显示ptsⅠ基因的缺失使得DE17的菌落颜色由白变为深红，并且形态变小。通过SYTO/PI染料对野生株和缺失株的生物被膜进行染色，研究生物被膜形成过程中死活菌的比例，结果显示在18h时，生物被膜形成能力最强，活菌比例最高。为了进一步研究生物被膜的形态结构，本研究对37℃培养18h的DE17及缺失株DE17ΔptsⅠ的生物被膜进行扫描电镜观察，结果显示，DE17的生物被膜结构包含了各种通道结构，表面含有大量的胞外基质，而缺失株DE17ΔptsⅠ与野生株DE17相比生物被膜变得稀疏，胞外间质减少，通道结构破坏。
　　本研究结果表明ptsⅠ基因不是AI-2的受体基因，缺失后是APEC毒力下降，影响细菌生物被膜的形成，为进一步从APEC生物被膜角度开展该病的防控提供新思路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1 禽致病性大肠杆菌研究概况

1．1 禽致病性大肠杆菌

1．2 禽致病性大肠杆菌的致病性

1．3 禽致病性大肠杆菌的耐药性及防控

2 密度感应系统研究现状

2．1 密度感应系统概述

2．2 密度感应系统分类

2．3 信号分子AI-2的研究现状

2．4 AI-2的检测

2．5 AI-2的拮抗剂的研究

2．4 密度感应系统的应用前景

第二章 禽致病性大肠杆菌ptsI缺失株的构建及其对AI-2内化的影响

2．1 材料

2．1．1 菌株及质粒

2．1．2 主要试剂及培养基配方

2．1．3 主要仪器设备

2．2 方法

2．2．2 PCR引物设计

2．2．3 DE17ΔptsI和DE17Δ1633缺失株和回复株的构建

2．2．4 缺失株DE17ΔptsI和DE17Δ1633内化外源AI-2能力检测试验

2．2．5 重组蛋白pET28a-PtsI的AI-2结合活性验证

2．3 结果

2．3．1．DE17ΔptsI和DE17Δ1633突变株和回复株的鉴定

2．3．2 缺失株DE17ΔptsI和DE17Δ1633内化外源AI-2能力检测试验结果

2．3．3 重组蛋白PtsI的表达纯化

2．3．4 重组蛋白PtsI与AI-2结合活性验证

2．4 讨论

第三章 ptsI对禽致病性大肠杆菌致病性的调控作用研究

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂及培养基

3．1．2 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．4．DE17、DE17ΔptsI和cDE17ΔptsI体内载菌量分析

3．3．2 DE17、DE17ΔptsI、DE17Δ1633和cDE17ΔptsI、cDE17Δ1633半数致死量LD50检测结果

3．3．3 DE17、DE17Δpts和cDE17ΔptsI对DF-1细胞黏附入侵能力检测结果

3．3．5．DE17、DE17ΔptsI和cDE17ΔptsI组织病理分析

3．4 讨论

第四章 ptsI对APEC生物被膜形成的调控作用

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂及培养基

4．1．2 主要仪器设备

4．2 实验方法

4．2．5 DE17、DE17ΔptsI扫描电镜检测

4．3 实验结果

4．3．2 DE17、DE17ΔptsI、DE17Δ1633和cDE17ΔptsI、cDE17Δ1633运动性检测

4．3．4 DE17、DE17ΔptsI和cDE17ΔptsI激光共聚焦检测

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介