细粒棘球绦虫粪抗原的筛选及ELISA检测方法的初步建立

摘要

棘球蚴病（俗称包虫病）是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）的中绦期（幼虫）——细粒棘球蚴寄生于动物和人的肝、肺及其他器官而引起的一种呈世界性分布人兽共患病。棘球蚴病对人体健康和畜牧业发展都产生了严重的危害，它不仅是一个特殊的医学和兽医学问题，而且更是一个严重的社会经济问题。
　　蛋白质组(proteome)是研究分析一个基因组表达的所有蛋白质，主要利用双向凝胶电泳(Two-Dimensional Electrophoresis，2-DE)作为其技术支撑。这一概念最早是在1994年的一次学术会议上由Marc Wilkins提出的。蛋白质组学(proteomics)是研究某一生物、组织或细胞在特定条件下基因组所表达的全套蛋白质特征的学科，其主要应用高分辨率的分离技术、质谱鉴定技术以及生物信息学技术。
　　本研究通过人工感染细粒棘球蚴原头节，收集感染后不同时间的犬粪样品，进行蛋白质提取和质谱分析，采用蛋白质组学、生物信息学、免疫学和分子生物学技术筛选鉴定理想的诊断抗原，结果显示，从粪上清液中共鉴定出蛋白质3242个，其中宿主（犬）蛋白3107个，细粒棘球绦虫蛋白135个。针对分析结果，选择特异性蛋白EMR、GAPDH、TMEM41B进行基因克隆，构建pET30a重组表达载体，在大肠杆菌中表达，用纯化表达产物建立细粒棘球绦虫感染犬粪抗原双抗夹心ELISA检测方法，以市售试剂盒检测确定的20份自然感染细粒棘球绦虫阳性犬粪上清为检测样品对筛选得到的蛋白进行评估。以重组蛋白pET30a-EMR免疫的动物血清为包被一抗（捕获抗体）时，检出阳性率为35％;以重组蛋白pET30a-GAPDH免疫的动物血清为包被一抗时，检出阳性率为45％;以重组蛋白pET30a-TMEM41B免疫的动物血清为包被一抗时，检出阳性率为25％。对人工感染多房棘球绦虫的犬粪样品进行检测，以重组蛋白pET30a-EMR免疫血清包被时，多房棘球绦虫的检测呈阳性，多头带绦虫、泡状带绦虫检测显示为阴性;以重组蛋白pET30a-GAPDH免疫血清包被时，多房棘球绦虫、多头带绦虫、泡状带绦虫检测显示均为阳性;以重组蛋白pET30a-TMEM41B免疫血清包被时，多房棘球绦虫、多头带绦虫的检测为阳性，泡状带绦虫检测显示为阴性。
　　本研究旨在建立细粒棘球绦虫粪抗原ELISA检测方法，能够及时、准确地检测流行区终末宿主棘球绦虫感染情况，从而为制定综合防控措施，控制棘球蚴病的流行提供技术支撑。本研究的方法和结果为今后进一步筛选和鉴定理想候选诊断抗原，研制犬细粒棘球绦虫感染粪抗原ELISA检测试剂盒提供了重要途径和参考依据。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 细粒棘球蚴病的流行史和危害

1．1．1 细粒棘球蚴病的流行史

1．1．2 细粒棘球蚴病的危害

1．2 蛋白组学的发展及蛋白质组学在细粒棘球绦虫研究领域中的应用

1．2．1 蛋白组学的发展

1．2．2 蛋白质组学在细粒棘球绦虫研究领域中的应用

1．3 细粒棘球绦虫粪抗原在研究领域中的应用

1．3．1 以成虫为诊断抗原的研究

1．3．2 以成虫表膜抗原为诊断抗原的研究

1．3．3 以虫体分泌抗原为诊断抗原的研究

1．3．4 以人工获得重组抗原为诊断抗原的研究

1．4 结合蛋白质组学展望细粒棘球绦虫粪抗原的应用

第二章 细粒棘球绦虫候选诊断抗原的筛选鉴定

2．1 材料与方法

2．1．3 动物感染与粪便处理

2．1．4 蛋白与肽段提取

2．1．5 基于QE的液质联用分析

2．1．6 蛋白的生物信息学分析

2．2 结果

2．2．1 未感染细粒棘球虫的犬粪样品蛋白鉴定结果

2．2．2 感染细粒棘球虫不同时间点犬粪蛋白的鉴定

2．3．3 犬粪中细粒棘球虫蛋白的功能富集

2．3 讨论

第三章 细粒棘球绦虫候选诊断抗原基因的克隆

3．1 材料与方法

3．1．1 细粒棘球绦虫、菌种

3．1．2 主要仪器与试剂

3．1．3 引物的设计与合成

3．1．4 细粒棘球绦虫总RNA的提取与反转录

3．1．5 虫体EMR、GAPDH、TMEM41B蛋白编码基因的PCR扩增

3．1．6 虫体EMR、GAPDH、TMEM41B蛋白编码基因的克隆

3．1．7 虫体EMR、GAPDH、TMEM41B蛋白(酶)的生物信息学分析

3．2 实验结果

3．2．1 虫体EMR、GAPDH、TMEM41B基因的克隆

3．2．2 虫体EMR、GAPDH、TMEM41B蛋白(酶)的生物信息学分析

3．3 讨论

第四章 细粒棘球绦虫候选诊断抗原基因的原核表达及ELISA方法的建立

4．1 材料与方法

4．1．1 实验动物、菌种及载体

4．1．2 主要仪器和试剂

4．1．3 重组蛋白表达载体的构建

4．1．4 EMR、GAPDH、TMEM41B重组蛋白的原核表达及其表达形式的鉴定

4．1．6 多克隆抗体的制备

4．1．7 抗体效价的测定

4．1．8 ELISA方法的初步建立

4．2 结果

4．2．1 重组表达载体的鉴定

4．2．2 重组蛋白的诱导表达

4．2．3 重组蛋白的纯化

4．2．4 抗体效价检测结果

4．2．5 粪抗原ELISA方法的检测结果

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历