通过转录组测序分析玉米耐受低磷胁迫的分子机制

摘要

玉米是全球广泛种植的粮食作物和能源作物，土壤低磷胁迫会严重制约玉米的生长，因此研究玉米耐低磷的分子机制具有重要意义。尽管利用microarray和RNA-seq技术已经鉴定出许多与玉米磷胁迫相关的基因，增加了我们对于玉米适应低磷胁迫机制的认知，但microarray只能检测已知基因，常规的RNA-seq技术不能区分来自第一条链和第二条链的信息;同时关于不同玉米基因型对低磷胁迫响应能力不同的机制需要也进一步探讨。本论文首先通过水培方法对玉米耐低磷材料进行筛选，然后对两种磷胁迫反应不同的自交系进行链特异性的转录组测序，并结合相关生理指标，来说明不同基因型玉米自交系对低磷胁迫适应性能力不同的分子机制;并进一步挖掘RNA-seq数据中的lncRNA，分析了这些lncRNA在玉米适应低磷胁迫中的潜在作用。得到的主要实验结论如下:
　　1、在水培条件下，对田间筛选得到的15份低磷敏感玉米自交系和15份耐低磷玉米自交系进一步筛选验证，根据低磷与正常磷条件下苗期地上部生物量的比值及花青苷、磷含量等生理指标，选择CCM454和31778作为耐低磷材料和低磷敏感材料进行进一步研究。
　　2、对31778和CCM454正常磷水培和低磷水培2天、8天的地上部和根部构建链特异性的转录组文库，并使用Illumina Hiseq2500测序仪进行PE125测序。分析测序结果发现31778和CCM454中共同的低磷胁迫响应基因主要参与了包括酸性磷酸酶在内的多种代谢过程，进一步实验测定发现低磷胁迫2天时CCM454根系分泌大量的酸性磷酸酶，而31778在低磷6天时才开始分泌大量的酸性磷酸酶，这与RNA-seq结果一致，表明CCM454对低磷胁迫的响应比31778迅速。同时对31778和CCM454在正常磷和低磷条件下的差异表达基因进行GO富集分析，结合二者体内的SOD、POD、CAT活性，发现CCM454体内的活性氧清除能力要强于31778。
　　3、RNA-seq数据经过组装、筛选，得到65099个lncRNA转录本，这些lncRNA的基本特征与他人报道一致;并对这些基因进行RT-PCR验证及测序，表明这些lncRNA具有可靠性。
　　4、通过分析测序数据，在31778和CCM454的根系中发现了16个差异表达的miRNA，地上部发现了12个差异表达的miRNA，包括目前公认的对磷胁迫产生响应的miR399，并且通过小RNA Northern实验发现低磷条件下31778中miR399的表达量要高于CCM454。通过psRobot软件预测得到6787个lncRNA可作为miR399的靶标，并且这些lncRNA在两材料间也表现为差异表达。表明miR399可能与这些lncRNA互作，参与玉米适应低磷胁迫。
　　5、采用WGCNA法对lncRNA和mRNA进行共表达网络分析，根据基因的连通性，得到一些可能与玉米适应低磷胁迫相关的核心lncRNA。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物适应低磷胁迫的机制研究

1．2 植物基因型与磷利用效率

1．3 玉米磷胁迫研究现状

1．4 逆境胁迫与ROS

1．5 转录组测序原理及应用

1．6 长链非编码RNA研究进展

1．6．1 长链非编码RNA的定义

1．6．2 LncRNA的作用机制及功能

1．6．3 LncRNA参与磷酸盐胁迫的研究进展

1．7 立题依据

1．8 技术路线

第二章 低磷胁迫反应极端自交系的筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器及耗材

2．1．3 实验试剂及药品

2．1．4 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 水培条件下低磷胁迫响应极端自交系筛选

2．2．2 31778和CCM454生理指标测定

2．3 讨论

第三章 不同玉米基因型对低磷胁迫的适应性机制

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器及耗材

3．1．3 实验试剂及药品

3．1．4 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 RNA质量检测

3．2．2 转录组测序及拼接结果分析

3．2．3 基因表达量分析

3．2．4 低磷胁迫与正常磷条件相比基因的差异表达分析

3．2．5 正常磷条件下31778和CCM454基因的差异表达分析

3．2．6 低磷胁迫条件下31778和CCM454中差异表达基因分析

3．3 讨论

第四章 低磷胁迫相关lncRNA的挖掘

4．1 材料与方法

4．1．1 LncRNA筛选

4．1．2 LncRNA分类

4．1．3 LncRNA基因表达量分析及差异表达分析

4．1．5 作为miR399靶标的lncRNA预测

4．1．6 基因共表达网络分析

4．2 结果与分析

4．2．2 LncRNA的特征分析

4．2．3 LncRNA的克隆验证

4．2．4 LncRNA在31778和CCM454中组织表达情况

4．2．5 LncRNA差异表达分析

4．2．6 miR399及其靶标lncRNA分析

4．2．7 基因共表达网络分析结果

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历