利用DNA条形码技术鉴别山葡萄种质资源的研究

摘要

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是中国重要的野生果树资源。山葡萄资源丰富，目前资源鉴别以形态学标记为主，这种方法简单但易受到环境因子及主观判断因素的影响。
　　DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种以分子进化为基本原理，以超市商品的扫描条码为理念，是利用一段标准的DNA片段进行准确、快速及自动化的物种鉴别的最新分子生物学技术。本研究以国家果树种质左家山葡萄圃中290份山葡萄资源为研究对象，利用DNA条形码技术，筛选和建立山葡萄种质资源DNA条形码，为山葡萄种质资源的亲缘关系、资源鉴别、基因定位及育种材料的早期选择等工作提供依据。
　　本研究选取核基因及叶绿体基因上的ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK共5个DNA片段，提取山葡萄11份种质资源共33个样本的基因组DNA，对其进行扩增及测序。通过序列扩增效率及测序成功率，来研究DNA条形码在山葡萄资源中的通用性，同时分析各序列特征。重点筛选了2个DNA条形码候选序列ITS2和psbA-trnH序列，用于290份山葡萄资源DNA条形码的鉴别研究。
　　研究结果如下:
　　1.5个DNA条形码片段在山葡萄资源中的通用性分析:序列的扩增效率及测序成功率是DNA条形码片段鉴别成功的关键。ITS扩增效率较低，扩增效率及测序成功率分别为45.5％和30.3％。ITS2、psbA-trnH、rbcL、marK扩增效率为96.9％-100％，测序成功率为90.9％-100％，均具备良好的通用性，可作为山葡萄资源DNA条形码的候选片段进行深入研究。
　　2.DNA条形码序列特征分析:4个序列的全序列比对长度为422-896 bp;总变异位点为44-297个，GC含量为27.5％-64.5％。其中ITS2和psbA-trnH序列的变异位点分别为297个和238个，在山葡萄中的进化速率较快，可用于山葡萄资源鉴别的研究。
　　3.山葡萄资源DNA条形码的筛选和鉴别:通过种质间及种质内的变异性、Barcoding gap的分析和鉴别效率评估来评价ITS2及psbA-trnH序列的有效性。结果如下:
　　ITS2序列的种质内变异的变异度为1.036％，平均变异为0.970％，种质内最大变异为9.870％;种质间变异的变异度为11.375％，平均变异为10.203％，种质间最小变异为0.265％。Barcoding gap图中显示ITS2具有显著的barcoding gap。通过BLAST比对，ITS2序列的鉴别效率为55％，NJ树图分析ITS2序列的鉴别效率达75％。
　　PsbA-trnH序列的种质内变异的变异度为1.442％，平均变异为1.296％，种质内最大变异为2.426％;种质间变异的变异度为4.800％，平均变异为4.320％，种质间最小变异为2.650％。Barcoding gap图中显示psbA-trnH序列虽然存在部分重叠，但具备较显著的barcoding gap。通过BLAST比对，psbA-trnH序列的鉴别效率为60.5％，NJ树图分析psbA-trnH序列鉴别效率达85％，并对不同花型及地域的山葡萄进行鉴别。
　　将psbA-trnH序列作为山葡萄种质资源的DNA条形码候选序列，并将ITS2序列作为补充序列。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 DNA条形码概述

1．1．1 DNA条形码的概念及原理

1．1．2 DNA条形码的标准及优点

1．1．3 DNA条形码研究进展

1．1．4 DNA条形码候选片段研究

1．1．5 DNA条形码操作流程及分析方法

1．1．6 植物DNA条形码研究展望

1．2 分子标记在山葡萄种质鉴别上的研究

1．2．1 分子标记在山葡萄资源上的应用现状

1．2．2 分子标记在山葡萄资源鉴别中的优势与不足

1．3 论文研究的目的和意义

第二章 山葡萄DNA条形码序列的通用性及特征分析研究

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 山葡萄总DNA提取

2．2．2 引物筛选、PCR扩增及测序

2．2．3 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 PCR扩增效率和测序成功率

2．3．2 候选序列特征分析

2．3．3 候选序列种质间及种质内差异分析

2．3．4 候选序列Barcoding gap检验

2．3．5 候选序列鉴别效率评价

2．4 讨论

2．4．1 ITS2序列分析及变异位点的探讨

2．4．2 PsbA-trnH序列分析及变异位点的探讨

2．4．3 Mark序列分析及变异位点的探讨

2．4．4 RbcL序列分析及变异位点的探讨

2．5 本章小结

第三章 山葡萄种质资源的DNA条形码鉴别研究

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 山葡萄总DNA的提取

3．2．2 PCR扩增及测序

3．2．3 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 山葡萄种质资源的ITS2序列鉴别结果与分析

3．3．2 山葡萄种质资源psbA-trnH序列鉴别结果与分析

3．4 讨论

3．4．2 DNA条形码候选序列—psbA-trnH序列的讨论

3．4．3 山葡萄种质资源的DNA条形码候选序列的讨论

3．5 本章小结

第四章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历