两个水稻细胞核雄性不育基因的图位克隆

摘要

水稻花药角质层和蜡质层是花粉囊发育重要的结构支撑和安全屏障。本文针对两个来自中恢801560Co-γ辐射诱变突变体库中的无花粉型雄性不育突变体whf41和whf34进行了表型分析和基因精细定位，为进一步克隆这两个核雄性不育基因并研究其调控水稻花粉发育的分子机理提供理论基础。主要结果如下:
　　1、突变体whf41花药瘦小且呈透明乳白色，成熟期花药中不包含花粉粒。花药半薄切片观察结果显示，whf41小孢子无法形成正常的花粉外壁、绒毡层细胞异常膨大而不进行正常的程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)，最终膨胀的绒毡层和花粉细胞碎片逐渐融合并充满药室;扫描电镜结果进一步发现突变体花药内外壁均呈平滑状而缺乏脂类物质，花粉细胞逐渐破碎并降解。通过遗传分析，认为whf41突变体的无花粉型雄性不育性状是由一对隐性核基因控制，我们将该基因精细定位于3号染色体短臂上的XD-5和XD-11这两个标记之间，物理距离45.6Kb，这其中包含9个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。序列分析显示该区间内一个细胞色素P450基因LOC_Os03g07250的第4个外显子处存在1个单碱基替换和3个碱基的缺失，导致其翻译序列发生一个氨基酸的替换（天冬氨酸→甲硫氨酸）和一个氨基酸（缬氨酸）的缺失，致使其功能改变进而出现该表型。qRT-PCR检测结果表明，whf41突变体中CYP704B2和一系列花药脂质合成与转运相关基因的表达水平均发生了显著下调，进一步证明OsWHF41在花药的脂质合成与花粉壁形成过程中具有重要作用。
　　2、突变体whf34，其花药在花药大小，饱满度和颜色方面都与野生型有较大差别，whf34花药与野生型相比明显弱小且干瘪无形，颜色变成了透明白色，花药中不包含花粉粒。半薄切片观察结果显示whf34未能形成正常花粉壁，绒毡层降解时期推后，花粉细胞碎片与绒毡层细胞混合后在后续阶段降解，花药室成空腔状态，花药不开裂。扫描电镜结果进一步证明了突变体花药内外壁均是平滑状，缺乏孢粉素和乌氏体，未发现花粉粒。通过遗传分析，认为whf34突变体的无花粉型雄性不育性状是由一对隐性核基因控制，我们将该基精细定位在第7号染色体长臂的w46和w18之间约57.2 kb的范围内，该区间内包含7个开放阅读框。对这7个ORF分别进行测序分析，结果发现在ORF4(LOC_Os07g42970)的第1个外显子区存在一个A（腺嘌呤）向C（胞嘧啶）的单碱基突变，致使其编码区的第63位氨基酸由天冬氨酸(Asp)突变为丝氨酸(Ser)。qRT-PCR检测结果表明，whf34中的一系列与绒毡层降解和花粉壁形成相关的基因除WDA1以外，其他基因在whf34中的相对表达量均明显下降，更深层次证实了OsWHF34在花药壁和绒毡层发育过程中的重要作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 绒毡层

1．1．1 绒毡层发育过程

1．1．2 绒毡层发育的调控因子

1．2 花粉壁

1．2．1 花粉壁的结构及形成过程

1．2．2 胼胝质的合成和降解及其相关基因

1．2．3 初生外壁发育过程和小孢子细胞膜流动及其相关基因

1．2．4 孢粉素前体组成物质的合成及其相关基因

1．2．5 含油层的形成过程及其相关基因

1．2．6 花粉内壁的形成过程及其相关基因

1．3 花粉壁形成过程中的具体物质代谢及相关的基因作用关系

1．3．1 与脂类物质代谢过程相关的基因作用关系

1．3．2 与酚类物质代谢过程相关基因的作用

1．3．3 与多糖代谢过程相关基因的作用

1．3．4 花粉发育过程中前体组成物质在花药组织中的运输

1．4 花粉壁发育的协调调控

1．5 角质素

1．6 本研究意义

第二章 水稻无花粉型核雄性不育突变体whf41的鉴定与基因定位

2．1 材料与方法

2．1．4 扫描电镜观察

2．1．5 DNA的提取和基因定位

2．1．6 候选基因分析

2．1．7 实时荧光定量PCR分析

2．2 结果与分析

2．2．1 突变体表型分析

2．2．2 花药半薄切片分析

2．2．3 whf41花药和花粉外璧的扫描电镜观察

2．2．4 突变体遗传分析

2．2．5 目的基因的定位与序列分析

2．2．6 花药发育相关基因的表达分析

2．3 讨论

第三章 水稻无花粉型核雄性不育突变体whp4的鉴定与基因定位

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料及田间管理

3．1．2 花粉育性调查

3．1．3 花药发育的半薄切片观察

3．1．4 扫描电镜观察

3．1．5 DNA的提取和基因定位

3．1．6 候选基因分析

3．1．7 RNA的提取

3．1．9 实时荧光定量PCR分析

3．2 结果与分析

3．2．1 突变体表型分析

3．2．2 花药半薄切片分析

3．2．3 花药和花粉外壁的扫描电镜观察

3．2．4 突变体遗传分析

3．2．5 目的基因的定位与序列分析

3．2．6 花药发育相关基因的表达分析

3．3 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介