两个水稻突变体的遗传与生理生化分析

摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。水稻突变体是功能基因组学研究的重要材料，水稻突变体创制方法包括:自发突变，物理诱变，化学诱变以及插入突变。其中，化学诱变中的甲基磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)诱变应用最为普遍。
　　本研究利用从EMS诱变籼稻品种中鉴100构建的突变体库中筛选出7份突变体材料:M15，M50，M85，M89，M96，M117和M270。其中，M15，M50，M85，M89，M117和M270这6个突变体从分蘖期(M85，M89，M117)或者抽穗期(M15，M50，M270)开始分别呈现出叶片提前黄化衰老的表型，并一直延续到植株成熟。此外，突变体M96表现为另一种类型的散生匍匐突变表型。
　　农艺性状考察结果显示，与野生型相比，这6个突变体在株高、穗数、穗长、千粒重以及结实率上都存在部分显著差异，也就是说突变体的叶片早衰表型对农艺性状产生了一定的消极影响，从而影响了最终的产量与品质。此外，这6份突变体的农艺性状受早衰表型的影响程度并不均一，其中突变体M85、M89和M117与其他的突变体以及野生型相比，农艺性状受影响程度最大。
　　在抽穗期，与野生型中鉴100相比，这6个突变体中的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量显著上升，而叶绿素含量显著下降。活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)清除系统相关酶活性的变化表明这6个突变体中活性氧清除系统遭到了破坏。光合参数的测定表明6份突变体的叶片早衰减弱了光合作用的速率和强度。
　　透射电镜观察结果表明，与野生型相比，这6个突变体中的叶绿体和基粒类囊体数目都显著减少，其中突变体M50的叶绿体发育还存在着严重的损伤;而突变体M85和M89叶绿体中淀粉粒的数目增加且尺寸也变大;突变体M15、M117和M270叶绿体中的嗜饿颗粒数目明显多于野生型。这说明6份突变体材料叶肉细胞中叶绿体的发育与结构存在异常。
　　利用这6份突变体为母本材料，分别通过与不同的父本材料配制杂交组合，对其F1的表型进行考察以及F2群体的表型分离进行统计。遗传分析的最终结果表明该6个突变体的表型均是由单隐性核基因控制。
　　我们对突变体M85做了进一步的研究，通过图位克隆的方法将突变体M85的目标基因定位在第七染色体的短臂标记RM7153和RM1186之间，物理距离约321kb。组织化学分析和黑暗诱导实验表明，突变体M85中存在大量的ROS积累并导致了细胞死亡，而其对黑暗诱导衰老的响应不敏感。
　　突变体M96从发芽开始就出现严重的匍匐向地性生长表型，并且该表型贯穿突变体M96的整个生育阶段。与野生型相比，该突变体的分蘖角度和分蘖数显著增加。组织切片观察分析表明，突变体M96茎秆第二节点周围发生了细胞的不对称生长。通过图位克隆的方法，我们将该目标基因定位在11染色体长臂约506kb的区间内，随后对该区间内的候选基因进行测序分析，发现基因LOC_Os11g29840的第三个外显子上发生了一个碱基G到T的突变。实时定量PCR分析表明，该目标基因的在突变体茎秆中的表达量高达野生型中的4倍多。

目录

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摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1．2 水稻早衰的表型特征

1．1．3 衰老的生理生化变化

1．1．4 水稻衰老相关突变体的遗传分析与基因定位

1．1．5 水稻衰老相关基因的克隆与功能分析

1．1．6 水稻早衰突变体的研究意义

1．2．1 前人研究进展

1．2．2 水稻散生株型相关突变体的研究意义

第二章 六份早衰突变体的遗传与理化分析

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 表型鉴定及农艺性状考察

2．2．2 衰老相关生理生化指标测定

2．2．3 细胞超微结构透射电镜观察

2．3 结果与分析

2．3．1 突变体的表型

2．3．2 突变体生理生化相关指标变化

2．3．3 突变体的叶肉细胞叶绿体发育

2．3．4 突变体遗传分析

2．4 小结

第三章 早衰突变体M85的基因定位与理化鉴定

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 突变体M85的基因定位

3．2．2 突变体M85黑暗诱导与SPAD值测定

3．2．2 突变体M85组织化学及TUNEL检测

3．3 结果与分析

3．3．1 突变体M85基因定位

3．3．2 突变体M85黑暗诱导

3．3．3 突变体M85组织化学分析及TUNEL检测

3．4 小结

第四章 散生匍匐突变体M96的鉴定与基因定位

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 突变体M96幼苗重力性反应与外源激素处理

4．2．2 茎秆组织切片观察

4．2．3 突变体M96遗传分析及基因定位

4．2．3 突变体M96候选基因分析

4．2．4 实时荧光定量PCR

4．3 结果与分析

4．3．1 突变体M96表型分析

4．3．2 外源激素与光对突变体M96向重力性的影响

4．3．3 突变体M96的遗传分析和基因定位

4．3．4 组织切片观察

4．3．5 目的基因表达水平分析

4．3．6 同源蛋白结构和进化分析

4．3 小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历