基于CRISPR/Cas9介导的绵羊WNT2与FGF5基因编辑研究

摘要

毛囊(Hair follicles，HF)是控制羊毛生长发育的器官，次级毛囊的发生是决定细羊毛品质的关键因素，涉及一系列表皮和真皮间持续而复杂的信号通路调控，但对控制次级毛囊发育的相关基因的调节机理却鲜有研究。在本实验室前期研究过程中发现，WNT2在次级毛囊形态发生诱导期表达量差异显著，为进一步研究WNT2基因对毛囊形态发生过程的分子调控机制，并为改善羊毛品质提供技术支撑，本研究首先应用CRISPR/Cas9技术在绵羊细胞水平验证敲除WNT2对毛囊发育关键基因的调控作用;并以高山美利奴羊为研究对象，进一步建立基于显微注射受精卵基因编辑FGF5的技术体系。主要研究结果如下:
　　1.培养绵羊原代皮肤成纤维细胞，设计并构建了pUC-sgRNA-pSpCas9(BB)-2A-Puro WNT2敲除质粒，通过阳离子脂质体进行细胞转染，通过T7E1酶切试验进行编辑后效率为14.35％，说明成功对WNT2基因进行了基因编辑。通过Q-PCR技术分析WNT2敲除后对毛囊发育相关基因表达的影响，结果表明WNT2相对表达量极显著下调(P＜0.01)，CDH1相对表达量极显著上调(P＜0.01)，说明WNT2基因编辑成功导致其表达量下降，下游基因表达量上调。Caspase3及FGF5表达上调显著（P＜0.05），证明了WNT2基因对FGF5表达存在抑制作用，同时WNT2基因表达下调会激活凋亡通路，导致细胞凋亡，研究证明WNT2对毛囊的生长发育具有促进作用，为进一步开展WNT2对绵羊毛囊形态发生的分子调控机制研究奠定了理论基础。
　　2.通过研究不同促卵泡刺激素（follicle stimμLating hormones，FSH）使用剂量，给药方式及冬季畜舍温度对超数排卵及胚胎移植的影响，优化高山美利奴羊胚胎回收程序，以最大化每次回收中受精卵数量。通过比较，最优的冬季高山美利奴羊ET方案超数排卵及胚胎回收程序应为，畜舍内温度为-8℃，按照六次递减法肌肉注射10mL Folltropin-V，每次注射剂量为2.5mL，2mL，2mL，1.5mL，1mL，1mL的进行超排，并于供体第一次配种后40小时进行胚胎回收。对经过基因编辑实验的后代样本进行研究发现，通过TA连接检测及T7E1酶切鉴定，证明成功对高山美利奴羊受精卵进行了基因编辑并获得了FGF5基因敲除后代，建立了高山美利奴羊基因编辑试验方法，获得了FGF5基因敲除个体，为进一步应用基因编辑技术改善羊毛品质提供了技术支撑。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 绵羊毛囊的形态发生的分子调控机制研究进展

1．1．1 毛囊的基本结构

1．1．2 毛囊的形成与发育

1．1．3 调节毛囊发育的相关通路

1．1．4 WNT2基因的研究背景

1．1．5 FGF5基因在毛囊发育过程中作用

1．2 CRIPSR／Cas9系统介导的基因编辑技术

1．2．1 CRISPR／Cas9系统的研究背景

1．2．3 SgRNA的功能

1．2．4 Cas9蛋白的结构与功能

1．3 本研究的目的及意义

第二章 绵羊原代皮肤成纤维细胞WNT2基因编辑试验

2．1 材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 试剂及试剂盒

2．1．3 主要试剂的配置

2．1．4 实验动物及材料

2．2 方法

2．2．1 绵羊皮肤成纤维原代细胞的分离与培养

2．2．2 sgRNA设计

2．2．3 载体构建

2．2．4 细胞Puro致死剂量的确定

2．2．5 细胞转染

2．2．6 T7E1突变率分析

2．2．7 实时荧光定量PCR

2．2．8 统计分析

2．2．1 绵羊皮肤成纤维原代细胞的分离与培养

2．2．2 sgRNA的设计及编辑效率的验证

2．2．4 实时荧光定量PCR结果

2．4 讨论

2．5 小结

3．1 材料

3．1．1 主要仪器及设备

3．1．2 试剂及试剂盒

3．1．4 实验动物及环境

3．2 方法

3．2．1 供体同期发情及超数排卵处理

3．2．2 受体同期发情处理

3．2．3 胚胎回收

3．2．4 胚胎培养及显微注射

3．2．5 胚胎移植

3．2．6 手术时血清中激素浓度的测定

3．2．7 FGF5基因编辑结果的检测

3．2．8 统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 不同超数排卵处理结果

3．3．2 胚胎移植结果

3．3．3 血清FSH浓度检测结果

3．3．4 FGF5基因编辑检测结果

3．4 讨论

3．4．1 高山美利奴羊超数排卵及胚胎移植效果

3．4．2 不同FSH处理对胚胎移植的影响

3．4．3 超数排卵过程中不同环境温度对胚胎移植的影响

3．4．5 FGF5基因编辑结果

3．5 小结

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介