兰州熊蜂雌性蜂蛋白质组与MicroRNA分析

摘要

兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)以其群势大、易饲养和授粉性能优良等优点成为我国重点繁育和推广的本土熊蜂。蜂王产卵对于整个蜂群的建立和发展起决定性的作用，关系到熊蜂繁育的成败，然而，生产中往往出现蜂王不明原因的不产卵现象。因此，本文详细阐述了影响熊蜂雌性蜂产卵的因素，并利用蛋白质组学的方法，分析兰州熊蜂产卵与未产卵雌性蜂血淋巴蛋白质的差异;通过高通量测序技术对产卵与未产卵蜂王卵巢MicroRNA进行预测和差异分析，最后，对两个主要候选蛋白进行了基因克隆与表达分析，主要取得如下结果:
　　1.兰州熊蜂雌性蜂血淋巴蛋白质组研究
　　本研究采用凝胶电泳技术（2-DE）和GeLC-MS/MS两种蛋白质组学研究策略，对兰州熊蜂产卵与未产卵蜂王和工蜂血淋巴进行分析，结果显示:血淋巴总蛋白浓度可以作为判断雌性蜂产卵的标志;获得兰州熊蜂雌性蜂产卵与未产卵状态血淋巴蛋白质的表达谱。通过LC-MS/MS鉴定蛋白未产卵蜂王275个，产卵蜂王314个，未产卵工蜂783个和产卵工蜂463个;其中，雌性蜂共同表达的蛋白数量为128个，差异表达蛋白数量为44个;通过GO分析，发现产卵前后蜂王和工蜂的血淋巴蛋白质功能组成发生了明显的改变，雌性蜂产卵后，富集于生殖过程、行为以及一些分子功能及细胞组成的蛋白增多，富集于应对刺激反应和一些细胞代谢氧化功能的蛋白减少。
　　2.兰州熊蜂蜂王卵巢microRNA研究
　　利用rnirDeep2对兰州熊蜂蜂王卵巢组织进行miRNA预测，共获得329个已知miRNA，其中有75个是蜜蜂已知的成熟miRNA;利用地熊蜂基因组进行比对和预测，共获得255个新的兰州熊蜂成熟miRNA。通过miRNA表达差异性分析，发现所有表达差异显著的miRNA中，表达趋势均是产卵后下调。利用4种算法筛选适合兰州熊蜂蜂王miRNA表达分析的内参基因，结果表明:miR275是兰州熊蜂蜂王不同生殖状态下头部和卵巢组织中表达水平最稳定的基因;在不同组织中，miR277是卵巢中表达最稳定的内参基因，而miR275是头部中表达最稳定的内参基因。
　　3.兰州熊蜂IRP30基因克隆及表达分析
　　通过RACE和降落PCR技术克隆了兰州熊蜂IRP30基因的cDNA全长，结果表明:兰州熊蜂IRP30基因共有一个转录本，其全长为1082bp，编码区序列(CDS)长度为825bp，共编码275个氨基酸，N端具有信号肽序列。通过保守结构域分析表明，IRP30在35-180个氨基酸之间具有多个富亮氨酸重复区。通过荧光定量的方法分析表明，IRP30在Pb（棕眼）和Pb1（棕眼体表浅着色）蛹期时，表达量极显著高于其他时期(p＜0.01); IRP30表达量变化规律，在三型蜂之间为:工蜂＞蜂王＞雄性蜂，在不同组织间为:胸部＞头部＞腹部，其中，在头、肌肉和脂肪体中的相对表达量较高。通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术分析表明，与未产卵状态相比，雌性蜂产卵后IRP30的转录和蛋白表达均极显著上调(p＜0.01)，推测该蛋白参与雌性蜂生殖转变过程。
　　4.兰州熊蜂PEBP基因克隆及表达分析
　　利用RACE技术克隆了兰州熊蜂PEBP基因的cDNA全长，结果表明:PEBP基因全长为1217bp，共有2个转录本PEBPX1和PEBPX2，其全长分别为1005 bp和915 bp，编码区序列(CDS)长度分别为627 bp和549 bp，共编码208和182个氨基酸，其中，PEBPX1的N端具有信号肽序列，PEBPX2不含信号肽序列。通过采用绝对荧光定量PCR分析表明，在卵、Pb1和Pbd蛹期，PEBP两个转录本的表达量均极显著高于其他时期(p＜0.01)，除Pha（预成虫）期外，PEBPX2的表达量均显著高于PEBPX1(p＜0.05)，表明熊蜂不同发育时期对PEBPX2的偏好性更强。通过绝对荧光定量和蛋白免疫印迹分析表明，兰州熊蜂蜂王和工蜂由未产卵状态转变为产卵状态后，PEBP的mRNA表达量极显著升高(p＜0.01)，且PEBPX2的表达量高于PEBPX1，在蛋白水平也具有相同的趋势，推测该蛋白参与熊蜂雌性蜂的生殖过程。
　　综上所述，本研究明确了兰州熊蜂产卵与未产卵蜂雌性蜂血淋巴蛋白质在数量、种类和功能三个方面的差异情况，并预测了不同生殖状态蜂王卵巢miRNA的种类和数量，并获得表达差异的miRNA，同时筛选出评估兰州熊蜂蜂王miRNA表达量的最适内参基因，最后明确了候选蛋白IRP30和PEBP在兰州熊蜂中的表达特性。本研究为开展熊蜂分子生物学和生殖生理研究奠定重要理论基础，也为熊蜂的工厂化繁育和大规模应用提供科学依据。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 熊蜂概况

1．1．1 熊蜂蜂群生活史

1．1．2 熊蜂蜂群组成及发展特点

1．1．3 熊蜂繁育与授粉价值

1．2 熊蜂蜂王产卵研究进展

1．2．1 营养对蜂王产卵的影响

1．2．2 环境对蜂王产卵的影响

1．2．3 激素对蜂王产卵的作用

1．2．4 蜂王产卵相关的分子研究

1．3 熊蜂工蜂生殖机制的研究

1．3．1 信息素对工蜂生殖的影响

1．3．2 工蜂产卵的分子机制

1．4 总结和展望

1．5 本研究目的、内容和意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究内容

1．5．3 研究技术路线

1．5．4 研究意义

第二章 兰州熊蜂雌性蜂血淋巴蛋白质组研究

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 产卵与未产卵雌性蜂血淋巴总蛋白浓度差异分析

2．2．2 产卵与未产卵雌性蜂血淋巴蛋白质1-DE电泳分析

2．2．3 产卵与未产卵雌性蜂血淋巴蛋白质表达图谱分析

2．2．4 产卵与未产卵雌性蜂血淋巴双向电泳鉴定蛋白质表达量聚类分析

2．2．5 产卵与未产卵雌性蜂血淋巴蛋白数量和种类差异分析

2．2．6 兰州熊蜂雌性蜂血淋巴蛋白功能富集分析

2．2．7 荧光定量PCR验证

2．3 讨论

第三章 兰州熊蜂蜂王卵巢MicroRNA预测与分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 兰州熊蜂蜂王卵巢miRNA长度特性

3．2．2 兰州熊蜂蜂王卵巢组织miRNA预测

3．2．3 兰州熊蜂卵巢组织miRNA差异表达

3．2．4 内参基因表达水平分析

3．2．5 候选内参基因稳定性组合排序

3．2．6 最佳内参基因数量的确定

3．2．7 最佳候选内参基因的验证

3．3 讨论

第四章 兰州熊蜂IRP30基因克隆与表达分析

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 IRP30基因的分子克隆和生物信息学分析

4．2．2 兰州熊蜂IRP30的表达特性

4．2．3 IRP30在产卵与未产卵蜂王和工蜂中的表达分析

4．3 讨论

第五章 兰州熊蜂PEBP基因克隆与表达分析

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 PEBP基因的分子克隆和生物信息学分析

5．2．2 PEBP的系统发育分析

5．2．3 PEBP基因表达分析

5．2．4 PEBP蛋白表达分析

5．3 讨论

第六章 全文结论

6．1 全文结论

6．2 研究展望

参考文献

附录

致谢

作者简历