西花蓟马对多杀霉素抗性近等基因系的建立及抗性机制研究

摘要

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种世界性的重要农业害虫，可以通过其锉吸式口器取食，并且能够在植物间传播病毒造成间接危害。由于西花蓟马具有体型小、隐蔽性强、繁殖力高、孤雌生殖、生活史短等特点，使其很容易对杀虫剂产生抗性，田间防治困难。多杀霉素属于大环内酯类杀虫剂，是刺糖多孢菌有氧发酵后的次级代谢产物，是一类对环境和非靶标动物友好的生物源农药。多杀霉素的主要作用靶标为烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs），次要靶标为γ-氨基丁酸受体(GABA)。尽管多杀霉素类是目前防治蓟马类害虫最为有效的药剂之一，但已有多例田间抗性的报道，研究其对多杀霉素的抗性机制对于西花蓟马的防治和抗性治理具有重要意义。本研究测定了6个西花蓟马田间种群对7种杀虫剂的抗药性，建立了西花蓟马对多杀霉素抗性的近等基因系，建立了nAChR a6亚基缺失型转录本比例与多杀霉素抗性水平的线性模型，并用田间种群进行了验证，研究了叶用莴苣上西花蓟马的防治指标。
　　1.西花蓟马田间种群对不同药剂的抗药性测定
　　2016年测定了北京海淀和延庆、河北石家庄、云南元谋和上蒜、西藏拉萨6个地区的西花蓟马对多杀霉素、乙基多杀霉素、溴虫腈、高效氯氰菊酯、噻虫嗪、阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）的抗药性。结果表明所有种群对多杀霉素和乙基多杀霉素产生了不同程度的抗药性，其中北京海淀种群对乙基多杀霉素的抗性水平高达2395倍，建议停止使用该类药剂;对阿维菌素类药剂的抗性水平在不同种群之间差异大，建议减少使用;除西藏种群外，其他种群对溴虫腈较为敏感，且溴虫腈的毒力较高，推荐使用;对高效氯氰菊酯和噻虫嗪的敏感性呈上升趋势，建议合理使用。云南上蒜地区西花蓟马的抗药性问题最为严重，对甲维盐、阿维菌素、乙基多杀霉素和多杀霉素均达到极高抗水平，其中对甲维盐的抗性水平超过4000倍。建议各地根据抗性水平和药剂的毒力合理选择药剂，并集成建立综合防治措施。
　　2.叶用莴苣上西花蓟马的防治指标研究
　　采用人工接虫的方法，分别于春、秋季进行2次试验，研究西花蓟马虫口密度与叶用莴苣产量损失率之间的关系。线性回归分析结果表明，西花蓟马虫口密度与叶用莴苣产量损失率之间呈显著正相关;大棚种植叶用莴苣，西花蓟马的防治指标为5-6头·株-1，即当每株叶用莴苣上西花蓟马虫口数达到5-6头时，叶用莴苣产量显著降低，应及时进行防治。
　　3.西花蓟马抗多杀霉素的近等基因系建立
　　通过8代回交，获得了西花蓟马对多杀霉素抗性的近等基因系种群NIL-R。对遗传相似度的检测结果表明，敏感亲本Ivf03与抗性亲本Spin-R的遗传相似度为0.6395，此后随着回交次数的增加而不断增大，最终的近等基因系抗性种群NIL-R与敏感亲本Ivf03的遗传相似度达到了0.9890，且生物测定结果表明NIL-R对多杀霉素的抗性倍数为36，000倍，与抗性亲本Spin-R的抗性水平相当。此外还筛选出了8条在西花蓟马中具有稳定的多态性扩增的ISSR引物，并设计正交试验，对西花蓟马ISSR-PCR的反应体系进行了优化。体系优化的结果表明，体系各因素对扩增结果的影响从大到小依次为:dNTPs浓度＞引物浓度＞Taq酶含量＞DNA含量＞Mg2+浓度;最佳反应体系为1.0 mmol·L-1 Mg2+，0.25 mmol·L-1 dNTPs，2μmol·L-1引物，0.5 U的Taq DNA聚合酶以及30 ng模板DNA。
　　4.西花蓟马多杀霉素抗性机理研究
　　在室内建立了5个西花蓟马对多杀霉素不同抗性水平的品系，利用RT-PCR和大量测序获得5个种群的nAChR a6亚基的转录本，建立了缺失型转录本比例与对多杀霉素抗性水平之间的关系。结果表明a6亚基缺失型转录本的比例与抗性倍数之间存在线性关系，回归方程为:y=5.4392x-1.2038，相关系数R2=0.9765。说明西花蓟马对多杀霉素的抗性水平越高，缺失型转录本所占的比例越多，因此推测nAChR a6亚基的功能性缺失突变是西花蓟马多杀霉素抗性形成的分子机制。用5个不同地区的西花蓟马田间种群对该模型进行验证，所得卡方值为0.2914(x2=0.2914＜x23，0.05=7.815)，说明田间种群数据与模型预测数据之间无显著差异，该模型同样适用于田间情况，可作为田间多杀霉素抗性监测的分子诊断方法。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 西花蓟马概况及防治指标

1．1．1 西花蓟马简介

1．1．2 西花蓟马的抗药性现状

1．1．3 防治指标

1．2 多杀霉素概况

1．2．1 多杀霉素简介

1．2．2 昆虫对多杀霉素的抗药性现状

1．2．3 多杀霉素抗药性机理研究

1．3 烟碱型乙酰胆碱受体概况

1．4 近等基因系概况

1．4．1 近等基因系简介

1．4．2 昆虫抗性近等基因系研究

1．5 研究内容及意义

1．5．1 研究内容

1．5．2 研究意义

第二章 西花蓟马田间种群对不同药剂的抗药性测定

2．1 材料与方法

2．1．1 供试试剂

2．1．2 供试虫源

2．1．3 室内生物测定

2．2 试验结果

2．3 讨论

第三章 叶用莴苣上西花蓟马的防治指标研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 数据处理

3．2 试验结果与分析

3．2．1 不同虫口密度对叶用莴苣单株质量及产量损失率的影响

3．2．2 不同虫口密度与叶用莴苣产量损失率的相关关系

3．3 讨论

第四章 西花蓟马对多杀霉素抗性近等基因系的建立

4．1 材料与方法

4．1．1 供试虫源

4．1．2 主要仪器和试剂

4．1．3 室内生物测定

4．1．4 西花蓟马近等基因系构建

4．1．5 DNA提取

4．1．6 ISSR-PCR反应体系优化

4．1．7 利用ISSR评估种群近等性

4．2 结果

4．2．1 西花蓟马抗性近等基因系的建立

4．2．2 ISSR-PCR反应体系优化

4．2．3 遗传相似度测定

4．3 讨论

第五章 西花蓟马对多杀霉素的抗性机理研究

5．1 实验材料

5．1．1 供试虫源

5．1．2 主要仪器

5．1．3 主要试剂

5．2 实验方法

5．2．1 各种群的室内生物测定

5．2．2 总RNA提取

5．2．3 cDNA合成

5．2．4 烟碱型乙酰胆碱受体a6亚基克隆

5．3 实验结果

5．3．1 nAChR a6亚基缺失型转录本与室内种群抗性水平的关系

5．3．2 田间种群验证结果

5．4 讨论

第六章 全文总结

参考文献

致谢

作者简历