西瓜果实成熟乙烯调控的生理及分子机制初探

摘要

植物肉质果实成熟是高度复杂但协调有序的遗传调控过程。乙烯已被明确为控制呼吸跃变型果实成熟的关键激素。近年来，在部分非呼吸跃变型果实如草莓、葡萄、柑橘等中同样也发现乙烯参与了其成熟调控过程，并已取得重要研究进展。西瓜传统上被划分为非呼吸跃变型果实。与野生西瓜不同，栽培西瓜成熟时果肉颜色、质地、风味等均发生显著变化，但其成熟机理尚知之甚少。本论文以果实成熟调控研究模式作物番茄为参照，通过早熟栽培西瓜品种97103和不能成熟的野生西瓜种质PI296341-FR进行生理生化及转录组的对比分析，系统研究了乙烯在参与西瓜果实成熟中的作用及其生理与分子调控机制，重点对差异显著表达的ERF基因ClERF069进行了功能验证，取得如下主要结果:
　　1、西瓜果肉组织中乙烯合成水平很低，但可能在成熟调控中发挥重要作用。西瓜果实释放乙烯量极低以至难以测定，而果实组织内乙烯含量相对要高，且真实反映了其乙烯合成水平。栽培西瓜97103成熟期内果肉组织内乙烯水平大概只有呼吸跃变型果实番茄的1/10，但成熟起始时（授粉后18天），果肉组织内乙烯含量明显上升（增加了约3倍）并达到峰值。而野生西瓜PI296341-FR果肉组织内乙烯含量整个发育期基本稳定维持在较低的水平。用外源乙烯处理两个西瓜品种，栽培西瓜97103授粉后10天和授粉后18天的果肉组织明显变软，颜色发育明显加快，主要色素物质番茄红素、β-胡萝卜素等相比对照明显增加。而野生西瓜PI296341-FR果肉组织也明显变软，但瓤色未发生变化。以上结果说明，乙烯可能在西瓜果实软化以及类胡萝卜素合成的瓤色发育等成熟性状代谢调控中充当重要角色。
　　2、西瓜发育成熟过程中，两个ACS基因和两个ACO基因在果肉组织乙烯合成代谢中起关键作用，可能也是构成类似呼吸跃变型果实的乙烯合成系统Ⅱ的重要成员。栽培西瓜97103和野生西瓜PI296341-FR发育成熟过程中，果肉组织内ACS和ACO酶活性变化与乙烯含量之间表现出同步性。西瓜全基因组上共鉴定出八个ACS基因和八个ACO基因。通过qRT-PCR分析发现整个发育成熟过程中，ACS基因Cla022653、Cla011522和ACO基因Cla014827、Cla016287在两个品种果肉组织内的表达量均与ACS、ACO酶活性以及乙烯含量之间存在同步性。用外源乙烯处理，97103西瓜果肉组织内源乙烯含量显著增加，说明西瓜果肉中乙烯合成具有类似呼吸跃变型果实自我催化的乙烯合成系统Ⅱ特性。这种类似的乙烯合成系统Ⅱ不仅存在于西瓜成熟果肉组织内（授粉后18天），在未成熟果肉组织中（授粉后10天）也同样存在。ACS基因Cla011522、Cla022653以及ACO基因Cla014827、Cla016287表达量均受外源乙烯诱导而上升，说明这四个基因在西瓜果实成熟过程中对乙烯合成起重要作用，可能也是构成乙烯合成系统Ⅱ的重要成员。
　　3、基于转录组数据进行差异表达和共表达分析，发现NAC、HD-Zip、ERF等多个基因家族转录因子可能调控了西瓜果实乙烯合成。结合基因组注释和西瓜97103、PI296341-FR不同发育成熟时期的果皮、果肉组织的转录组测序数据分析，我们对乙烯信号转导以及乙烯上游调控相关转录因子等相关基因进行差异表达分析和共表达分析，得到几个在西瓜成熟过程中可能参与乙烯合成调控的转录因子基因，如MADS-box家族基因Cla017291、NAC家族基因Cla019099、HD-Zip家族基因Cla017080等。同时分析还发现，多个ERF基因在表达上与成熟呈正相关或负相关，而且与乙烯合成、信号转导、NAC和MADS-box转录因子以及类胡萝卜素合成及果实软化等成熟代谢关键酶基因间都存在共表达关系，形成了以其为核心的共表达基因簇。因此，在乙烯信号介导的成熟调控及乙烯合成调控中ERF家族基因可能起到非常重要的作用。
　　4、西瓜ERF基因ClERF069转化番茄并过表达发现，番茄果实乙烯合成受到抑制且果实成熟延迟。基于栽培西瓜97103和PI296341-FR杂交形成的重组自交系群体进行了成熟相关性状的QTL精细定位结果，进一步对控制类胡萝卜素和可溶性糖合成的主定位区间内400多个基因进行转录谱差异表达筛选，得到一个重要的ERF家族候选基因Cla013424，并命名为ClERF069。qRT-PCR分析发现，RILs群体中果肉组织番茄红素和可溶性糖含量与ClERF069基因表达量之间呈负相关。在此研究基础上，通过农杆菌介导的叶盘转化法将CaMV35S∶ClERF069转入M82番茄中过表达，获得转基因番茄T2代多个株系，发现ClERF069基因过表达的番茄果实番茄红素和β-胡萝卜素含量降低，果实成熟时间延迟。同时，果实内乙烯合成也受到抑制。ERF基因ClERF069可能通过抑制果实乙烯合成从而推迟果实的成熟。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 乙烯生物合成及信号转导通路研究进展

1．1．1 乙烯生物合成

1．1．2 乙烯合成系统Ⅰ与系统Ⅱ

1．1．3 乙烯信号转导通路

1．2 乙烯介导的果实成熟的转录调控研究进展

1．3 乙烯调控非呼吸跃变型果实成熟研究进展

1．4 西瓜果实成熟研究进展

1．5 本研究的目的和意义

第二章 西瓜果肉组织乙烯合成水平很低，但可能在成熟调控中发挥重要作用

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料与取样

2．2．2 方法

2．3 结果与分析

2．3．1 西瓜果实乙烯释放速率很低，在授粉后10天未成熟期最高

2．3．2 果肉组织乙烯含量值明显高于乙烯释放速率值，其在97103西瓜内随成熟而增加

2．3．3 西瓜果肉组织中ACS、ACO活性均随成熟升高，ACS可能是果肉组织内乙烯合成的主要限制因素

2．3．4 外源乙烯对果肉组织内乙烯合成的影响

2．3．5 外源乙烯对果肉组织内ACS和ACO酶活性的影响

2．3．6 外源乙烯对西瓜颜色发育的影响

2．3．7 外源乙烯对果肉组织内可溶性固形物含量的影响

2．3．8 外源乙烯对果肉组织硬度的影响

2．4 讨论

2．4．1 西瓜果肉组织中乙烯合成水平很低

2．4．2 乙烯可能参与了非呼吸跃变型果实西瓜的成熟调控

2．5 小结

第三章 两个ACS和两个ACO基因在西瓜果肉组织乙烯合成中起关键作用

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与取样

3．2．2 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 西瓜ACS、ACO基因鉴定及系统发育分析

3．3．2 西瓜ACS、ACO基因时空表达分析

3．3．3 外源乙烯对果肉组织内4CS和ACO基因表达的影响

3．4 讨论

3．4．2 西瓜果肉组织内乙烯合成具有自我催化特性

3．5 小结

第四章 基于转录组的可能调控西瓜乙烯合成的转录因子筛选分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 总RNA提取及转录组测序

4．2．2 差异表达分析

4．2．3 基因系统发育分析

4．2．4 共表达分析

4．3 结果与分析

4．3．1 可能调控乙烯合成的转录因子家族基因差的异表达分析

4．3．2 可能调控乙烯合成的转录因子家族基因的共表达分析

4．4 讨论

4．4．1 表达差异分析筛选可能比较重要的乙烯信号转导元件

4．4．2 表达差异分析和共表达分析筛选分析可能调控乙烯合成的转录因子

4．5 小结

第五章 ERF基因ClERF9可能参与乙烯合成及果实成熟调控

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料与取样

5．2．2 方法

5．3 结果与分析

5．3．1 QTL精细定位结合转录组学分析得到一个成熟相关候选基因Cl013424，并命名为ClERF069

5．3．2 ClERF069表达与西瓜成熟负相关

5．3．3 ClERF069基因在番茄中的转化及功能分析

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历