6种Bt蛋白对绿盲蝽及其捕食性和寄生性天敌的潜在影响

摘要

自1996年，转基因植物首次在全球6个国家商业化种植以来，其全球种植面积持续、迅速增长，至2016年在全球26个国家的种植面积达1.85亿公顷，其中转基因抗虫植物的种植比例高达41％。这些抗虫植物中表达的杀虫物质多是来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的特异性杀虫晶体蛋白。转基因抗虫作物的种植，有效地控制了其靶标害虫的发生危害，减少了广谱性化学杀虫剂的使用量，保护了害虫天敌和自然环境，但也带来一些潜在的问题，如靶标昆虫抗性进化和对农田非靶标生物的影响等。Bt抗虫棉在我国的推广种植，虽然有效地控制了棉铃虫（Helicoverpa armigera）的危害，但在这种低农药Bt棉田环境下，棉田中一些盲蝽类害虫如绿盲蝽(Apolygus lucorum)的发生危害逐渐加重，目前已发展成为Bt棉田中的主要害虫。目前针对绿盲蝽的防治措施主要以化学防治为主，然而这种单一的化学防治措施不仅导致绿盲蝽对杀虫剂抗性的快速进化，对盲蝽类害虫天敌也有不利影响，还污染自然环境。因此，需要寻求新的有效的防治策略用于控制绿盲蝽的发生危害、频繁爆发。比如发展对盲蝽类害虫有效的转基因抗虫作物。去年已经有报道说发展了能够有效控制盲蝽类害虫发生危害的抗虫棉，虽然其环境安全性及商业化推广应用时间仍未可知，但抗盲蝽类转基因抗虫作物在农业中的应用是未来农业发展的一种趋势。因此，在此之前，有必要建立评价杀虫化合物对绿盲蝽及其捕食性天敌和寄生性天敌毒性影响的生测体系。
　　本文首先根据转基因抗虫植物对其非靶标生物环境安全性评价中Tier-1直接试验评价体系的基本要求，建立了一种评价杀虫化合物对绿盲蝽及其寄生性天敌红颈常室茧蜂（Penstenus spretus）潜在毒性影响的评价体系;之后利用该体系评价了目前转基因抗虫作物广泛表达的5种Cry蛋白，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Aa和Cry2Ab对绿盲蝽及其寄生性天敌的毒性影响;此外，利用之前已经报道的异色瓢虫（Harmonia axyridis）和大草蛉（Chrysopa pallens）直接试验评价体系，也评价供试5种杀虫蛋白对这2种天敌的潜在影响;在三级营养试验中，以对这5种杀虫蛋白不敏感的昆虫分别作为绿盲蝽捕食性和寄生性天敌的猎物或寄主，研究了Cry杀虫蛋白通过食物链对这几种害虫天敌的潜在毒性影响;最后，利用上面建立的直接试验评价体系，评价新型蛋白Cry2Ah对绿盲蝽、异色瓢虫、大草蛉和红颈常室茧蜂的潜在毒性。全文主要研究结果如下:
　　1.饲料适合度验证结果显示，绿盲蝽在所选人工饲料上能够完成正常的生长发育，其若虫存活率大于80％;砷酸二氢钾(KH2AsO4，PA)在饲料中的浓度大于等于4μg/g或一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂（N-[反式-环氧丁二酰基]-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，E-64）在饲料中的浓度大于等于2μg/g可以用作绿盲蝽直接试验体系中的阳性对照物质浓度。当供试5种Cry蛋白以高浓度单独或混合混入绿盲蝽饲料中，对其若虫、成虫生长发育以及体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性没有显著影响。
　　2.利用之前发展的评价杀虫化合物对异色瓢虫和大草蛉直接毒性影响的生测体系，评价了供试5种Cry蛋白对异色瓢虫和大草蛉这2种捕食性昆虫天敌生长发育和其体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性的直接影响，发现供试Cry蛋白对这2种昆虫生长发育及测定酶活性没有显著影响。当这2种捕食性天敌以取食过Cry蛋白的昆虫作为猎物时，其生长发育与对照组相比，没有受到不利影响。
　　3.E-64大于等于2μg/g可以用作评价杀虫化合物对红颈常室茧蜂直接毒性影响生测体系中的阳性对照物质浓度;将供试Cry蛋白以高浓度通过蜂蜜水提供给红颈常室茧蜂成虫，对成蜂寿命和寄生率等生长发育参数以及测定消化酶、解毒酶和保护酶活性没有明显影响;当红颈常室茧蜂以取食过Cry蛋白的绿盲蝽若虫作为寄主时，Cry蛋白通过食物链对供试寄生蜂幼虫及蛹的生长发育也无明显影响。
　　4.分别利用之前发展的检测杀虫化合物对绿盲蝽、异色瓢虫、大草蛉和红颈常室茧蜂直接毒性影响的生测体系，评价了新型杀虫蛋白Cry2Ah对这几种非靶标昆虫的毒性影响。结果表明，取食含有高浓度Cry2Ah的饲料，对这几种昆虫的生长发育及体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性没有显著影响。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 转基因植物概述

1．2 杀虫晶体蛋白概述及其作用机理

1．3 Bt作物长期推广种植带来的潜在问题

1．4 靶标昆虫对Bt毒索的抗性进化

1．5 抗性治理策略

1．5．1 庇护所策略

1．5．2 多基因策略

1．5．3 改造毒素

1．5．4 发展新毒素

1．6 转基因抗虫植物的环境安全性评价

1．6．1 实验室试验

1．6．2 半田间试验

1．6．3 田间试验

1．7 研究背景及内容

1．7．2 研究内容

第二章 Bt蛋白对绿盲蝽潜在影响的评价

2．1 材料与方法

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 供试化合物和生物测定

2．1．3 试验条件

2．1．4 绿盲蝽人工饲料适合度验证

2．1．5 生测体系有效性验证

2．1．6 Cry蛋白对绿盲蝽若虫和成虫的毒性影响

2．1．7 绿盲蝽若虫及成虫Cry蛋白摄入量检测

2．1．8 人工饲料中Cry蛋白稳定性和生物活性检测

2．1．9 Cry蛋白对绿盲蝽消化酶、解毒酶和保护酶活性影响

2．2 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 Cry蛋白对敏感棉铃虫的毒性测定

2．3．2 绿盲蝽人工饲料适合度验证

2．3．3 生测体系有效性和灵敏性验证

2．3．4 Cry蛋白对绿盲蝽若虫及成虫的潜在影响

2．4 讨论

第三章 Bt蛋白对异色瓢虫和大草蛉的潜在影响

3．1 材料与方法

3．1．1 供试昆虫

3．1．2 供试化合物

3．1．3 试验条件

3．1．4 Cry蛋白对异色瓢虫和大草蛉的潜在影响

3．1．5 异色瓢虫和大草蛉的Cry蛋白摄入量检测

3．1．8 Cry蛋白通过靶标昆虫对异色瓢虫和大草蛉的间接影响

3．1．9 Cry蛋白通过非靶标昆虫对异色瓢虫和大草蛉的间接影响

3．2 数据统计

3．3 结果和分析

3．3．1 Cry蛋白对异色瓢虫和大草蛉生物学的直接影响

3．3．2 异色瓢虫和大革蛉Cry蛋白摄入量检测

3．3．3 异色瓢虫和大草蛉人工饲料中Cry蛋白稳定性和生物活性检测

3．3．4 异色瓢虫和大草蛉幼虫及成虫体内主要酶活性测定

3．3．5 Cry蛋白通过靶标昆虫对异色瓢虫和大草蛉的生物学影响

3．3．6 Cry蛋白通过非靶标昆虫对异色瓢虫和大草蛉的生物学影响

3．4 结论与讨论

第四章 Bt蛋白对红颈常室茧蜂的潜在影响

4．1 材料与方法

4．1．1 供试昆虫

4．1．2 供试化合物

4．1．3 试验条件

4．1．4 生测试验中红颈常室茧蜂饲养方法

4．1．5 红颈常室茧蜂取食不同浓度E-64的生物学反应

4．1．6 Cry蛋白对红颈常室茧蜂的生物学影响

4．1．7 红颈常室茧蜂Cry蛋白摄入量检测

4．1．8 Cry蛋白稳定性和生物活性检测

4．1．9 取食Cry蛋白对红颈常室茧蜂主要酶活性影响

4．1．10 三级营养试验

4．2 数据统计分析

4．3 结果与分析

4．3．1 红颈常室茧蜂对E-64的剂量反应

4．3．2 Cry蛋白对红颈常室茧蜂的生物学影响

4．3．3 红颈常室茧蜂Cry蛋白摄入量检测

4．3．4 Cry蛋白稳定性和生物活性检测

4．3．5 取食Cry蛋白对红颈常室茧蜂主要酶活性影响

4．3．6 Cry蛋白通过食物链对红颈常室茧蜂的生物学影响

4．3．7 Cry蛋白在食物链中的传递

4．4 结论与讨论

第五章 Cry2Ah对其非靶标昆虫的毒性评价

5．1 材料与方法

5．1．1 供试昆虫

5．1．2 供试化合物

5．1．3 试验条件

5．1．4 Cry2Ah对绿盲蝽若虫和成虫的潜在影响

5．1．5 Cry2Ah对异色瓢虫和大草蛉幼虫及成虫的潜在影响

5．1．6 Cry2Ah对红颈常室茧蜂的潜在影响

5．1．7 数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 Cry2Ah对敏感棉铃虫的生物活性

5．2．2 Cry2Ah对绿盲蝽的潜在影响

5．2．3 Cry2Ah对异色瓢虫和大草蛉的潜在影响

5．2．4 Cry2Ah对红颈常室茧蜂的潜在影响

5．3 结论与讨论

第六章 全文总结

6．1 全文主要结论

6．2 有待进一步完成的工作

6．3 创新点

参考文献

致谢

个人简历