干扰素诱导蛋白2’-5’寡腺苷酸合成酶样蛋白的抗猪瘟病毒活性研究

摘要

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种严重危害许多国家养猪业的烈性动物传染病。先天免疫防御系统会筑就机体抵抗病毒感染的第一道防线，其中干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)在宿主抗病毒防御中起关键作用。CSFV感染宿主后，激活Ⅰ型IFN信号通路，引起其下游的ISGs转录表达，发挥抗CSFV作用。当前，抗CSFV特异性的ISGs及其抗病毒机制研究报道较少。因此，筛选抗CSFV特异性的ISGs并解析其抗病毒机制具有重要意义。我们实验室前期利用过表达猪源ISGs细胞系结合表达萤火虫荧光素酶的报告CSFV，筛选到猪源2'-5'寡腺苷酸合成酶样蛋白(pOASL)为潜在的抗CSFV ISG。
　　本实验旨在鉴定pOASL是否为抗CSFV ISG，并解析其如何发挥抗CSFV作用。我们从CSFV滴度、基因组拷贝数及非结构蛋白Npro表达水平证实，在不同感染复数（MOI-0.1或1）、感染后不同时间(24或48 h)过表达pOASL均可显著抑制CSFV的复制，且pOASL从接毒后6h开始呈现抗病毒活性，在感染后12 h其抗病毒作用达到最大;相反，利用siRNA干扰分子有效下调内源性pOASL后，从CSFV滴度、基因组拷贝数及非结构蛋白Npro表达水平证实，沉默内源性pOASL显著促进了CSFV复制。基于以上研究，我们鉴定pOASL确为抗CSFV ISG。此外，我们探究了CSFV感染对pOASL表达的影响。结果表明，CSFV感染后的3、6、12、24、36和48h均可检测到PK-15细胞中pOASL mRNA转录水平发生上调，即CSFV感染能够上调PK-15细胞中pOASL的转录水平。与此同时，不同感染复数（MOI=0.1和1）的CSFV感染PK-15细胞，也能上调pOASL的转录水平。pOASL为OAS蛋白家族成员且具有OAS结构域，在pOASL抗CSFV机制方面，其可能利用经典的OAS/RNase L通路发挥抗病毒作用。试验结果证实，沉默内源性RNase L后，pOASL仍具有抗CSFV活性，即pOASL发挥抗病毒作用并不依赖于RNase L通路。我们进一步研究pOASL发挥抗CSFV作用是否依赖于IFN信号通路，研究结果证实pOASL能够增强IFN-β信号通路。
　　总之，我们鉴定了pOASL为抗CSFV ISG，其发挥抗病毒作用依赖于增强Ⅰ型IFN信号通路而不依赖于经典的OAS/RNase L通路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1．1 猪瘟及其危害性

1．1．2 猪瘟病毒简介

1．1．3 猪瘟病毒蛋白与病毒增殖及其拮抗宿主免疫的研究进展

1．2 干扰素与干扰素刺激基因

1．2．1 干扰素简介

1．2．2 干扰素刺激基因的产生

1．2．3 干扰素刺激基因抗病毒研究进展

1．3 OASL及OAS家族蛋白

1．3．2 OAS家族抗病毒机制研究进展

1．4 研究的目的和意义

第二章 干扰素诱导蛋白2’-5’寡腺苷酸合成酶样蛋白的抗猪瘟病毒活性研究

2．1 材料和方法

2．1．1 细胞、菌株、载体和毒株

2．1．2 主要试剂和相关仪器设备

2．1．3 质粒的构建和转染

2．1．4 稳定表达pOASL的PK-15细胞系构建

2．1．5 细胞活力测定

2．1．6 RNA干扰试验

2．1．7 病毒滴度测定

2．1．8 Western blotting检测

2．1．9 RNA提取及反转录

2．1．10 荧光定量RT-PCR

2．1．11 双荧光素酶报告试验

2．1．12 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 过表达pOASL细胞系构建及细胞活力测定

2．2．2 过表达pOASL抑制CSFV复制

2．2．3 沉默内源性pOASL促进CSFV复制

2．2．4 CSFV感染后pOASL转录水平上调表达

2．2．5 pOASL抗CSFV不依赖RNase L通路

2．2．6 pOASL增强Ⅰ型干扰素信号通路

2．3 讨论

第三章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历