亚洲玉米螟Bt抗性种群的遗传多样性研究

摘要

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是玉米的重要害虫。虽然我国目前尚未批准转基因抗虫玉米商业化种植，国内外研发的表达Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1Ie，Cry1Ah，Cry1F等Bt(Bacillus thuringiensis)杀虫毒素转基因玉米为高效防治玉米螟做好了潜在的新技术储备。近二十年来，在北美、西欧、南美、菲律宾等20多个国家大面积商业化应用Bt玉米防治欧洲玉米螟Onublialis(Hubner)等鳞翅目害虫的实践证明，其不可避免的胁迫靶标害虫产生遗传分化，产生新的抗性种群。精准有效的抗性检测方法将为抗性监测和抗性治理策略的有效性提供科学依据。
　　利用MISA(MicroSAtellite)软件对高通量测序所得的亚洲玉米螟转录组数据进行搜索，对61，622条EST(Expressed Sequence Tag)序列进行分析，检测出3，467个SSR(Simple Sequence Repeats)位点。SSR发生频率为493％，出现频率为563％，平均每15，162bp含有1个SSR位点。其中，主要重复类型是三核苷酸，占SSR总数的514％，单核苷酸次之，为234％，二核苷酸占142％，四、五、六核苷酸重复的数量极少，分别占总数的56％、31％、23％。
　　通过设计、筛选，共获得3，316对特异性引物，从中挑选了150对进行PCR扩增，优化退火温度，共有51对扩增出目的条带。对本实验室建立起的亚洲玉米螟敏感种群(ACB-BtS)及以Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1Ah，Cry1F和Cry1Ie5种Bt毒素分别汰选的抗性种群ACB-AbR，ACB-AcR，ACB-AhR，ACB-FR和ACB-IeR进行多态性检测，最终得到20对高多态性标记引物。
　　应用筛选出来的20对多态性引物对亚洲玉米螟敏感及不同Bt毒素抗性种群进行遗传多样检测。在6个种群共180个个体中检测到126个等位基因，平均观测杂合度和期望杂合度分别为04892和06183，种群的Nei's基因多样性指数平均为05376，Shannon信息指数平均为10015表明亚洲玉米螟种群具有非常丰富的遗传多样性。不同Bt抗性种群间产生了一定程度的遗传分化，种群间的平均遗传分化系数(FST)为01959，即种群间的遗传变异为196％，种群内的遗传变异为804％。根据遗传距离建立了UPGMA系统发育树，显示出了6个种群的遗传相似度，即ACB-AbR与ACB-AcR相似度高，ACB-FR与ACB-IeR相似度高。种群变异相似度规律与已报道的亚洲玉米螟对各Bt毒素的抗性演化及交互抗性规律相一致。
　　利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因对亚洲玉米螟不同Bt抗性种群进行了种群遗传变异分析。在6个种群144个个体中共发现14个单倍型，共享单倍型1个，ACB-BtS种群特有的单倍型最多。分子变异分析(AMOVA)结果表明，群体内遗传变异占480％，群体间遗传变异占520％，群体间产生了显著的遗传分化。基于种群间遗传距离构建UPGMA系统发育树，结果显示6个群体聚类分为两族，其中ACB-BtS种群自为一族，其他Bt抗性种群汇聚为一族。
　　以上结果表明，通过分析比较COⅠ基因，可以区分亚洲玉米螟敏感和受Bt毒素胁迫而产生的抗性种群，但不能够区分具体是哪个抗性种群。利用SSR技术能够区分和鉴定亚洲玉米螟受Bt毒素胁迫而产生抗性的遗传分化种群，获得了20对特异性多态性标记引物，可作为亚洲玉米螟不同Bt毒素抗性种群的分子检测方法。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 转Bt基因玉米的研究概况

1．2 昆虫对Bt作物产生抗性的研究

1．3 害虫对Bt的抗性监测

1．4 微卫星标记概述

1．5 微卫星标记在遗传多样性中的应用

1．6 线粒体基因在遗传多样性中的应用

1．7 本研究的目的与意义

第二章 亚洲玉米螟转录组微卫星序列的分布特征

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 微卫星六种碱基重复类型的分布特征

2．3．2 SSR各碱基重复类别的分布情况

2．4 讨论

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．3 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 微卫星引物筛选的电泳检测结果

3．3．2 多态性微卫星引物的筛选结果

3．3．3 微卫星位点的多态性评价

3．4 讨论

第四章 亚洲玉米螟遗传多样性分析

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 供试昆虫

4．2．2 实验试剂与仪器

4．2．3 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 微卫星位点的多态性分析

4．3．2 种群的遗传多样性分析

4．3．3 种群的聚类分析

4．4 讨论

第五章 种群的线粒体COI基因遗传变异分析

5．2．3 实验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 线粒体COI基因序列组成及变异结果分析

5．3．2 遗传距离特征

5．3．3 遗传变异

5．4 讨论

第六章 全文总结与展望

参考文献

致谢

作者简历