异噻唑啉酮类衍生物对斑马鱼胚胎发育的毒理学研究

摘要

异噻唑啉酮(Isothiazolinone)是一类人工合成的防腐剂，具有较好水溶性，广谱抗菌性，低毒性等特点而被广泛用于化工业产品。这类物质通常随着生活污水和工业废水进入环境水体中，对水环境和水生生物的影响日益严重。本研究以斑马鱼胚胎为模型，评价了甲基异噻唑啉酮（Methylisothiazolinone，MI），甲基氯异噻唑啉酮(Methylchloroisothiazolinone，CMI)，卡松（Kathon，CMI/MI=3/1）和苯并异噻唑啉酮(Benzisothiazolinone，BIT)的急性毒性及其作用机制。
　　本研究采用受精后3小时(3hours post-fertilization，3hpf)的斑马鱼胚胎，在28℃下静态暴露于MI等物质，持续96h，观测不同时期的毒理学终点。得到MI，CMI，卡松和BIT对斑马鱼胚胎96h半致死浓度(LC50)分别为6.09mg/L、4.79mg/L、5.55mg/L和3.34mg/L;96h半致畸浓度(TC50)分别为3.87mg/L、2.89mg/L、3.27mg/L和1.38mg/L。暴露胚胎出现不同程度的畸形，包括体轴弯曲、尾部发育不良、卵黄囊肿、心包囊肿等，幼鱼发育迟缓，体长变短，运动能力减弱，触碰反应迟钝等。更重要的是处理组48h(51hpf)胚胎孵化受到严重抑制，血管发育受到严重影响。根据《全球化学品分类和标签协调手册》（GHS）标准判定MI，CMI和卡松对斑马鱼胚胎具有高毒，BIT为剧毒。
　　本研究通过检测氧化应激标志物，发现MI等暴露96h后，处理组中MDA和ROS含量显著增加，抗氧化酶SOD和CAT活力出现不同程度下降，GST活性则升高。同时，qPCR检测结果进一步表明，抗氧化相关基因cat、gstp-2、cox-1、ucp-2表达量出现不同程度的上调，而sod,nqo-1下调。抗凋亡凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax的表达量呈现出促进细胞凋亡的趋势，caspase-3和caspase-9的表达量显著升高，表明内源性细胞凋亡程序被激活。MI等暴露48h后，细胞凋亡吖啶橙(AO)染色结果表明，凋亡细胞主要在卵黄囊、心包和尾部。
　　通过代谢组学分析，进一步评价MI、CMI和BIT的毒性作用和筛选标志代谢物。处理组胚胎能量代谢和氨基酸的代谢途径都受到了显著影响，MI暴露组中显著上调代谢物49个，下调49个;CMI暴露组中显著上调45个，下调62个;BIT暴露组中显著上调45个，下调73个。分析表明，MI等在斑马鱼体内不能被代谢，通过影响斑马鱼胚胎氨基酸代谢，能量代谢等途径，导致胚胎畸形，发育迟缓;造成肝脏损伤，引起严重的氧化损伤，最终导致胚胎死亡。
　　进一步探索MI等对细胞的毒性，发现其能显著抑制人子宫内膜癌细胞(HEC-1B)细胞增殖。同阳性对照组紫杉醇相似，处理组细胞停留在G0/G1期，增殖系数(PI)显著下降，且呈现明显的剂量-效应关系，PI指数:MI＞卡松＞CMI＞BIT。同时，组织切片结果验证了，MI等暴露能导致胚胎肝脏损伤，肝脏组织结构松散、空泡化和肝细胞肿胀等病理现象。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 异噻唑啉酮类衍生物简介

1．1．1 甲基异噻唑啉酮的理化性质

1．1．2 甲基氯异噻唑啉酮的理化性质

1．1．3 卡松的理化性质

1．1．4 苯并异噻唑啉酮的理化性质

1．2 异噻唑啉酮类物质的环境污染概述

1．2．1 异噻唑啉酮类物质环境残留现状

1．2．2 异噻唑啉酮类物质的危害和生态毒性

1．3 斑马鱼胚胎在毒理学研究中的应用

1．3．1 斑马鱼胚胎发育阶段简介

1．3．2 斑马鱼胚胎在毒理学研究中的优势

1．3．3 斑马鱼胚胎毒理学研究进展

1．4 氧化应激效应概述

1．5 本研究的内容、目的和意义

1．5．1 研究内容与方案

1．5．2 研究目的与意义

第二章 MI、CMI、卡松和BIT对斑马鱼胚胎的急性毒性作用

2．1 实验材料

2．1．1 动物材料与试剂

2．1．2 仪器与耗材

2．2 实验方法

2．2．1 斑马鱼养殖

2．2．2 暴露溶液配制与HPLC检测

2．2．3 急性暴露处理

2．2．4 形态学观察

2．2．5 数据统计分析

2．3 实验结果

2．3．1 暴露液稳定性

2．3．2 MI、CMI、卡松和BIT暴露对胚胎孵化率的影响

2．3．3 MI、CMI、卡松和BIT暴露对斑马鱼胚胎的致畸效应

2．3．4 MI、CMI、卡松和BIT暴露对胚胎的致死作用

2．3．5 MI、CMI、卡松和BIT暴露对胚胎心率和体长的影响

2．3．6 MI、CMI、卡松和BIT暴露对胚胎血管发育的影响

2．4 讨论

2．4．2 MI、CMI、卡松和BIT对斑马鱼胚胎发育早期的毒性

第三章 斑马鱼胚胎氧化应激效应分析

3．1 实验材料

3．1．1 动物材料与试剂

3．1．2 仪器与耗材

3．2 实验方法

3．2．1 急性暴露处理和样品收集

3．2．2 SOD、CAT、GST酶活性和MDA含量测定

3．2．3 ROS含量测定

3．2．4 斑马鱼胚胎细胞凋亡AO染色

3．2．5 数据统计分析

3．3 实验结果

3．3．1 SOD、CAT、GST活性和MDA、ROS含量

3．3．2 ROS和MDA相关性分析

3．3．3 IBR指数法评价异噻唑啉酮类化合物毒性

3．3．4 异噻唑啉酮类化合物导致斑马鱼胚胎细胞凋亡

3．4 讨论

3．4．1 斑马鱼胚胎氧化应激效应分析

3．4．2 MI、CMI、卡松和BIT暴露导致斑马鱼胚胎细胞凋亡

第四章 斑马鱼胚胎抗氧化和抗凋亡相关基因表达分析

4．1 实验材料

4．1．1 动物材料与试剂

4．1．2 仪器与耗材

4．2 实验方法

4．2．1 急性暴露处理和样品收集

4．2．2 提取样品总RNA和质量检测

4．2．3 氧化应激和细胞凋亡相关基因表达量qPCR验证

4．2．4 数据统计分析

4．3 实验结果

4．3．1 RNA样品质量控制

4．3．2 氧化应激相关基因表达水平

4．3．3 细胞凋亡相关基因表达水平

4．4 讨论

4．4．1 氧化应激标志基因表达水平分析

4．4．2 细胞凋亡标志基因表达水平分析

第五章 斑马鱼代谢组学分析

5．1 实验材料

5．1．1 动物材料与试剂

5．1．2 仪器与耗材

5．2 实验方法

5．2．1 急性暴露处理和样品收集

5．2．2 代谢物萃取和衍生化

5．2．3 上机检测

5．2．4 数据处理

5．3 实验结果

5．3．1 数据质量控制和有效峰值

5．3．2 主成分分析(PCA)

5．3．3 差异代谢物火山图和层次聚类分析

5．3．4 差异代谢通路途径和代谢通路

5．4 讨论

5．4．1 差异代谢物分析

5．4．2 差异代谢通路分析

第六章 细胞毒性及幼鱼组织切片分析

6．1 实验材料

6．1．1 材料与试剂

6．1．2 仪器与耗材

6．2 实验方法

6．2．1 HEC-1B细胞的复苏、培养和冻存

6．2．2 急性暴露处理和细胞增殖检测

6．2．3 斑马鱼幼鱼暴露处理及样品收集

6．2．4 幼鱼HE染色

6．3 实验结果

6．3．1 异噻唑啉酮类物质对细胞增殖影响

6．3．2 HE染色分析

6．4 讨论

6．4．1 异噻唑啉酮类物质的细胞毒性

6．4．2 异噻唑啉酮类物质的肝脏毒性

7．1 全文小结

7．2 创新

7．3 展望

参考文献

致谢

作者简历