连作土壤中黄瓜枯萎病菌的致病力变化规律及强、弱致病力菌株的转录组分析

摘要

黄瓜枯萎病由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum，Foc)侵染引起，在我国各黄瓜种植区普遍发生，是制约黄瓜生产的主要病害之一。研究表明，连作条件下黄瓜枯萎病日益加重。引起这种现象的原因主要包括土壤中病原菌数量的积累、土壤理化性质的恶化、土壤微生物区系的失衡以及植物的自毒作用等。而单一寄主与病原菌长期互作，是否会导致病原菌的致病力变异，从而造成病害加重，目前的研究相对较少。本研究在建立人工病圃的基础上，连续种植抗、感黄瓜品种五茬，以黄瓜与小麦，玉米和三叶草的轮作为对照，监测连作及轮作后枯萎病菌的致病力变化，结合多核苷酸序列的系统发育分析，明确菌株的变异情况。此外，利用初始的弱致病力菌株foc-3b与寄主诱导的强致病力菌株Ra-4侵染黄瓜前、后的转录组测序分析，筛选致病力分化相关的基因。具体结果如下:
　　(1)连作及轮作土壤中黄瓜枯萎病菌的致病力分化黄瓜连作及轮作5茬后，共分离到205株尖孢镰刀菌。上述菌株的致病力测定结果表明，连作及轮作后病原菌群体的致病力均出现明显分化。黄瓜连作后，弱与次弱致病型菌株(病情指数DI≤40)的比例从第三茬开始明显减低，而强致病型菌株(DI＞60)的比例显著增多，病原菌的致病力表现出增强趋势，并且抗病品种连作后病原菌群体的强致病型菌株比例明显高于感病品种(P＜0.05）;但黄瓜与其他作物轮作后，病原菌群体各致病型菌株的比例无明显变化。
　　(2)连作土壤中黄瓜枯萎病菌的群体遗传多样性分析基于TEF-1α、histone H3和IGS三个基因序列的遗传多样性及系统发育分析结果表明，连作后病原菌群体聚合为三个分支，出现明显的遗传分化，并且从抗病品种上分离到的病原菌群体的遗传多样性指数明显高于感病品种，其分化程度与连作茬次及病原菌致病力无明显相关性。
　　(3)强、弱致病力菌株的比较转录组分析转录组测序结果表明，侵染黄瓜后，强、弱致病力菌株中分别检测到2，858和2，595个差异表达基因(DEGs)。其中550个基因在强、弱致病力菌株中均检测到差异表达，其可能参与物质代谢、蛋白质的转运，氧化还原及植物细胞壁的修饰等生物学过程;而1，146个基因仅在强致病力菌株中差异表达，其参与的生物学过程主要涉及能量代谢、物质转运、氧化还原、细胞过程调控及大分子物质的修饰等。推测这些强、弱致病力菌株共有的及强致病力菌株中特有的DEGs可能参与了病原菌的侵染及致病力分化。
　　上述结果为连作条件下黄瓜枯萎病病害加重的原因提供了新的解释，为进一步研究黄瓜枯萎病菌致病力分化的机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 黄瓜枯萎病概况

1．1．1 黄瓜枯萎病的发生与危害

1．1．2 病原和侵染循环

1．1．3 黄瓜枯萎病的防治

1．2 连作条件下枯萎病加重的原因

1．2．1 土壤理化性质的恶化

1．2．2 土壤微生物区系的失衡

1．2．3 植物的自毒作用

1．2．4 病原菌数量的积累

1．2．5 病原菌致病力的变化

1．3 尖孢镰刀菌的致病力及遗传结构分化

1．3．1 尖孢镰刀菌的致病力分化

1．3．2 尖孢镰刀菌的群体遗传多样性

1．4 尖孢镰刀菌的致病相关基因研究进展

1．4．1 尖孢镰刀菌重要致病相关基因

1．4．2 黄瓜枯萎病菌的致病相关基因

1．4．3 致病基因的表达调控对病原菌致病力的影响

1．5 本研究的目的和意义

第二章 黄瓜连作条件下病原菌的致病力变化

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 供试栽培品种

2．1．3 供试田地

2．1．4 培养基及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 筛选用于田间接种的初始菌株

2．2．2 建立田间连作及轮作体系

2．2．3 田间病样的采集

2．2．4 病原菌的分离与鉴定

2．2．5 病原菌的致病力测定

2．2．6 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 田间接种初始菌株的筛选

2．3．2 田间连作及轮作体系的建立

2．3．3 病原菌的分离与鉴定

2．3．4 病原菌的致病力测定

2．4 讨论

第三章 连作土壤中黄瓜枯萎病菌的群体遗传多样性分析

3．1 实验材料

3．1．1 供试菌株

3．1．2 供试试剂

3．2 实验方法

3．2．1 提取上述菌株的DNA

3．2．2 测序及分析

3．3 结果与分析

3．3．1 不同茬次尖孢镰刀菌TEF1-α、H3及IGS基因序列的扩增

3．3．2 不同茬次病原菌群体的遗传多样性分析

3．3．3 系统发育分析

3．4 讨论

第四章 强、弱致病力尖孢镰刀菌菌株的转录组分析

4．1 实验材料

4．1．1 供试菌株

4．1．2 供试黄瓜品种

4．1．3 供试质粒

4．1．4 供试培养基

4．1．5 供试试剂

4．2 实验方法

4．2．1 致病力分化菌株的获得

4．2．2 观察Foc侵染黄瓜的过程

4．2．3 转录组取样

4．2．4 RNA提取及质量检测

4．2．5 构建cDNA文库

4．2．6 测序及数据处理

4．2．7 转录组序列的组装与Unigene功能注释

4．2．10 实时荧光定量PCR验证

4．3 结果与分析

4．3．1 抗、感品种继代培养

4．3．2 Foc侵染黄瓜过程的观察

4．3．3 RNA质量检测

4．3．4 转录组组装及功能注释

4．3．5 差异表达基因分析

4．3．6 致病相关基因分析

4．3．7 实时荧光定量PCR验证

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历