宿主细胞对小反刍兽疫病毒天然免疫应答机制的研究

摘要

小反刍兽疫PPR(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由PPRV(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的高致病性疫病，死亡率达50-80％。是世界动物卫生组织(Office International des Epizooties，OIE)规定必须报告的烈性动物传染病。PPRV对宿主的天然免疫抑制非常严重，但目前关于宿主对PPRV感染的天然免疫应答过程、抗病毒药物以及新型抗病毒技术开发等方面的研究不多。本文对上述问题进行了初步研究，取得如下结果:
　　1.PPRV在遗传进化过程中，其密码子使用模式受到基因组自身突变压力以及与宿主相关的翻译选择压力的影响。N蛋白作为一种重要的病毒复制相关蛋白，其编码基因高度适应宿主密码子使用模式，并且在形成正确的蛋白结构的过程中，其密码子使用偏嗜性以及宿主细胞tRNA丰度变化都受到影响。N蛋白在PPRV复制过程中发挥着重要作用，其蛋白高级构象的形成与密码子使用模式具有明显的相关性。
　　2.PPRV感染HEK293T细胞后可诱导细胞内IFN-β、IFN-λ2、IFN-λ3三种干扰素及ISG15、ISG56、CXCL10等几种抗病毒蛋白(ISG)的表达，外源加入IFN-alpha-2b及IFN-λ3后对PPRV复制有明显的抑制作用，而IFN信号通路抑制剂Jak-inhibitor，对宿主细胞自身产生的IFN的应答无抑制作用，反之，未感染PPRV的HEK293T细胞对外源加入的IFN的应答具有显著抑制作用。
　　3.PPRV感染细胞可以诱导宿主细胞自噬相关蛋白Atg13蛋白的表达，该蛋白可以激活Ⅰ型IFN及相关细胞因子的表达，这些表达产物同样具有抗病毒作用。此外，Atg13蛋白具有抑制PPRV的复制的功能，说明宿主Atg13蛋白除了具有自噬功能之外还具有激活天然免疫及抗病毒等其它重要功能。
　　4.病毒唑(Ribavirin)与霉酚酸(Mycophenolic)均具有显著的抗PPRV的作用，深入研究发现，Ribavirin通过抑制IMPDH酶的活性来阻止GTP pool的形成从而发挥抗病毒作用。
　　5.Vero细胞敲除Vinculin基因后，细胞的迁移率降低，PPRV在细胞中的复制效率也有所降低。
　　6.筛选到了抗PPRV感染的两种干扰素，初步分析了Ribavirin及Mycophenolic两种药物治疗PPRV感染的可能性，这也为藏羚羊等我国特有的珍稀小反刍动物感染PPRV后的治疗提供了可靠的依据。
　　以上研究结果为我们深入了解PPRV与宿主细胞天然免疫系统的相互关系奠定了基础，为PPR的防控提供了新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 国内外研究进展

1．1．1 PPRV的分子病原学特点

1．1．2 宿主对PPRV的天然免疫应答

1．1．3 干扰素的抗病毒作用

1．1．4 自噬相关蛋白在天然免疫中的作用

1．1．5 病毒唑(ribavirin)在抗病毒临床中的应用

1．1．6 宿主细胞黏着斑蛋白对病毒复制的影响

1．2 研究的目的与意义

第二章 PPRV基因组逮传进化的特征

2．1 实验材料

2．1．1 PPRV基因组序列

2．1．2 宿主密码子数据

2．2 实验方法

2．2．1 PPRV基因核苷酸使用偏嗜性的分析

2．2．2 PPRV基因密码子使用偏嗜性的分析

2．2．3 PPRV与宿主密码子使用的相似性

2．2．4 PPRV核衣壳蛋白(N)二级结构的分析

2．3 实验结果

2．3．1 PPRV在基因水平上核苷酸使用模式

2．3．2 PPRV不同基因在密码子使用模式上与宿主的适应性

2．3．3 PPRV不同基因同义密码子使用的特点

2．3．4 PPRV N蛋白高级结构的分析

2．3．5 密码子使用对于PPRV N蛋白折叠构象的影响

2．3．6 翻译速率在两种不同折叠构象连接处的变化

2．4 讨论

第三章 宿主细胞抗PPRV感染的天然免疫应答

3．1 实验耗材、试剂及其配制方法

3．1．1 细胞、病毒、质粒和引物

3．1．2 主要溶液的配置

3．1．3 实验设备

3．2 实验方法

3．2．1 PPRV在HEK293T细胞中的增殖

3．2．3 外源IFN的抗病毒作用

3．2．4 Jak inhibitor抑制IFN通路

3．2．5 PPRV激活Atg13基因的转录

3．2．7 Atg13蛋白激活产生的IFN抑制PPRV的作用

3．2．9 CCK8检测药物对细胞的毒性实验

3．2．10 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．2 PPRV感染HEK293T细胞后可激活产生IFN-β、IFN-λ3及相关ISG

3．3．3 外源IFN的抗病毒作用

3．3．4 Jak inhibitor抑制IFN通路

3．3．5 细胞毒性实验

3．3．6 PPRV激活Atg13基因的转录

3．3．7 过表达Atg13基因对PPRV复制的影响作用

3．3．9 Atg13蛋白激活产生的IFN对PPRV的抑制作用

3．4 讨论

第四章 病毒唑和霉酚酸的抗PPRV作用

4．1 实验材料

4．1．1 细胞、病毒

4．1．2 实验耗材、试剂及其配制方法

4．2 实验方法

4．2．1 药物毒性实验

4．2．2 Ribavirin抑制病毒增殖实验

4．2．3 Mycophenolic抑制PPRV增殖作用

4．2．4 荧光定量PcR

4．2．5 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 药物毒性实验

4．3．2 Ribavirin抑制PPRV增殖的作用及最佳作用浓度

4．3．3 Ribavirin抑制PPRV增殖的时间效应

4．3．4 确定Ribavirin对PPRV作用的最佳浓度

4．3．5 Ribavirin-Guanosine抑制病毒增殖实验

4．3．6 MycophenoIic抑制PPRV增殖作用

4．3．7 Guansine抑制Mycophenolic抗PPRV／Nigeria 75／1增殖作用

4．4 讨论

第五章 细胞内黏着斑蛋白对病毒复制的影响

5．1 实验材料

5．1．1 细胞、病毒及质粒

5．1．2 实验耗材、试剂及其配制方法

5．1．3 实验设备

5．2 实验方法

5．2．1 敲除质粒的构建

5．2．2 基因敲除细胞系构建

5．2．3 敲除细胞系的鉴定

5．2．4 细胞分选

5．2．5 western-blot检测

5．2．6 单克隆细胞的PCR及测序鉴定

5．2．7 细胞迁移实验

5．3 实验结果

5．3．1 vinculin敲除质粒的构建

5．3．2 基因敲除细胞系

5．3．4 western-blot检测

5．3．5 细胞迁移实验

5．3．6 PPRV在Vero细胞中的增殖实验

5．4 讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历