GSK-3介导β-catenin调控猪流行性腹泻病毒增殖

摘要

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhoea virus，PEDV)，为单股正链RNA(ssRNA)病毒，属于Ⅰ型冠状病毒科成员，对各年龄段猪均易感，对7日龄仔猪致死率高达100％。近年来，变异型PEDV的暴发对养猪业造成了严重的影响。病毒在感染细胞后能够引起细胞内多种信号通路发生变化，其中PI3K/AKT/GSK-3信号通路在调控病毒感染时发挥了重要作用，其中，GSK-3的下游底物β-catenin，能被GSK-3磷酸化而降解，在病毒转录调控的过程中发挥重要的作用。本实验室前期试验结果显示:PI3K/AKT/GSK-3信号通路的激活能够抑制PEDV在Vero细胞上的增殖。为进一步探索PEDV复制增殖的分子机制，本研究采用抑制剂抑制和真核表达载体过表达等方法，探究PI3K/AKT/GSK-3信号通路及下游信号因子对PEDV复制增殖的影响。本试验研究内容结果如下:
　　1.PEDV感染Marc-145细胞后，AKT在丝氨酸473(Ser473)位点的磷酸化蛋白水平增加，GSK-3α/β(Ser21/9)磷酸化蛋白水平增加;同时，β-catenin含量增加。用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制其活性后，AKT(Ser473)磷酸化被抑制，GSK-3α/β(Ser21/9)磷酸化水平降低，β-catenin含量也降低（表明GSK-3活性增加），PEDV在Marc-145细胞上的增殖受到抑制。试验结果表明PI3K/AKT信号通路的激活能够促进PEDV在Marc-145细胞中的增殖。
　　2.用抑制剂CHIR-99021在Marc-145细胞上抑制GSK-3活性后，β-catenin含量增加，病毒在Marc-145细胞上的复制受到抑制。该研究结果显示:GSK-3在活性降低后，能够使β-catenin含量增加从而抑制病毒的增殖。N蛋白是病毒的核衣壳蛋白，它对病毒复制、转录和翻译过程均有影响，在病毒复制增殖的过程中发挥重要的调节作用。为进一步了解并阐明GSK-3调控PEDV增殖的分子机制，我们在抑制GSK-3活性后的细胞上过表达p3×Flag-N真核表达质粒，发现在293T细胞及Marc-145细胞上加抑制剂后N蛋白表达量减少，而在Vero细胞上N蛋白表达增多。
　　3.在Marc-145细胞上，用抑制剂Salinomycin抑制Wnt/β-catenin通路后，β-catenin的含量明显降低，而病毒的复制增多。该研究结果表明:β-catenin的增加起到抑制病毒复制增殖的作用。为进一步探究β-catenin是否对PEDVN蛋白的复制产生影响，本试验将构建好的真核表达质粒p3×Flag-β-catenin和p3×Flag-N共转染到293T细胞。研究结果发现.β-catenin对N蛋白的表达具有明显的抑制作用。
　　综上所述，一方面，PEDV感染Marc-145细胞后，能够通过激活PI3K/AKT信号通路促进病毒增殖。另一方面，PI3K/AKT信号通路激活后能够通过抑制GSK-3的活性，使细胞内β-catenin表达量增加，进而通过抑制N蛋白的表达发挥抑制病毒增殖的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 猪流行性腹泻病毒概述

1．1．1 PEDV的流行历史

1．1．2 PEDV基因组与病毒结构

1．2 糖原合成酶激酶-3(GSK-3)相关机制的概述

1．2．2 糖原合成酶激酶-3(GSK-3)

1．2．3 GSK-3底物蛋白—β-catenin简介

1．3 研究目的与意义

第二章 PI3K／AKT信号通路调控PEDV复制的研究

2．1 材料方法

2．1．1 毒株和细胞

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 PEDV感染

2．1．5 MTS法检测抑制剂毒性

2．1．6 细胞蛋白活性抑制试验

2．1．7 荧光定量PCR分析

2．1．8 Western blot检测

2．1．9 TCID50测定

2．2 试验结果

2．2．1 PEDV激活Marc-145细胞内PI3K／AKT信号通路

2．2．2 抑制剂对细胞活性的影响

2．2．3 PI3K／AKT信号通路促进PEDV的增殖

2．2．4 抑制PI3K／AKT活性及PEDV感染后相关蛋白水平变化

2．3 讨论

第三章 GSK-3调控PEDV复制增殖的分子机制

3．1 材料方法

3．1．1 毒株和细胞

3．1．2 试剂

3．1．3 仪器

3．1．4 质粒转染

3．1．5 PEDV感染

3．1．6 抑制剂毒性检测及细胞抑制试验

3．1．7 荧光定量分析

3．1．8 Western blot检测

3．1．9 TCID50测定

3．2 试验结果

3．2．1 抑制剂对细胞活性的影响

3．2．3 抑制GSK-3活性后相关蛋白水平变化情况

3．2．4 GSK-3抑制后对PEDV N蛋白过表达的影响

3．2．5 过表达PEDV N蛋白对β-catenin表达的影响

3．3 讨论

第四章 β-catenin调控PEDV复制机制的研究

4．1 材料方法

4．1．1 毒株和细胞

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器

4．1．4 PEDV感染与检测

4．1．5 抑制剂毒性检测及细胞抑制试验

4．1．6 猪β-catenin真核表达载体的构建

4．1．7 质粒共转染

4．1．8 荧光定量分析

4．1．9 Western blot检测

4．1．10 TCID50检测

4．2 试验结果

4．2．3 猪β-catenin真核表达载体的构建

4．2．4 β-catenin与PEDV N蛋白表达相互抑制

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历