芳香烃受体相关的色氨酸代谢及检测方法研究

摘要

色氨酸(Tryptophan，Trp)是人体必需的8种氨基酸之一，为蛋白质营养价值评价的重要指标。色氨酸代谢物对人体的情绪、新陈代谢、细胞生长发育、生物节律的形成及免疫功能等均具有重要的调节作用。6-甲酰基吲哚并3-2-b咔唑(6-formylindole[3，2-b]carbazole，FICZ)是色氨酸的光解产物，也可由吲哚丙酮酸避光孵育产生。FICZ在纳摩尔级别即可诱导芳香烃受体(AHR)及其下游基因高表达，诱导Th17细胞的分化，正向调控免疫反应，这表明FICZ对提高机体免疫能力及预防、控制肿瘤具有特殊意义。然而，目前没有直接证据表明HCZ可在体内被合成。因此，找到人体中能够代谢色氨酸产生内源性FICZ的关键酶至关重要。L-氨基酸氧化酶(L-amino acidoxidase，LAAO)是代谢色氨酸产生吲哚丙酮酸的关键酶，其人源表达基因为IL4i1。因此，本文以研究人源LAAO酶是否为催化色氨酸产生FICZ的关键酶为出发点，通过非靶向及靶向代谢组学技术，对过表达IL4i1的293t细胞代谢色氨酸产生的AHR配体进行了定性及定量分析。主要实验内容及结果:
　　1.构建瞬时和稳定转染IL4i1基因的293t细胞，用蛋白分子免疫印迹实验对细胞上清液及细胞裂解液中的LAAO酶的表达进行检测，同时依据鲁米诺发光反应原理评估LAAO酶活。实验结果表明，人源IL4i1基因表达的LAAO酶在胞内表达，也能分泌到胞外，属分泌型蛋白，LAAO酶在37℃，pH为55时可高效催化色氨酸，转化率约为22％。
　　2.检测细胞上清诱导AHR报告细胞系荧光素酶表达量，用以反映LAAO酶代谢色氨酸产生AHR配体的水平。色氨酸经LAAO酶催化氧化之后，诱导荧光素酶表达的能力显著增加，表明LAAO酶的催化产物至少有一种为AHR的强激动剂。
　　3.建立FICZ、吲哚甲醛、吲哚乙酸、色氨酸、犬尿氨酸、犬尿酸的超高效液相色谱串联质谱检测方法，各检测物线性范围广，线性相关系数均为0999，定量限在005-1000 ng/mL之间，检出限在002-500 ng/mL之间，方法回收率为85％-102％,为实现色氨酸及其代谢物靶向定性和定量打下方法基础。
　　4.非靶向代谢组学结合靶向代谢物检测对LAAO酶代谢色氨酸产物进行定性及定量。结果表明，在实验条件下，FICZ不是LAAO酶的催化产物，而LAAO酶可代谢色氨酸产生吲哚甲醛和吲哚乙酸，其含量与细胞培养环境中的色氨酸浓度呈正相关。
　　吲哚甲醛和吲哚乙酸均为AHR配体，也是重要的免疫调节物质。本研究首次证实吲哚乙酸为LAAO酶催化色氨酸的的分解产物，也是首次发现吲哚甲醛可以由非细菌合成途径产生，为深入研究吲哚甲醛的体内合成和调控奠定理论基础，也为评估高色氨酸饮食的营养价值提供了新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 色氨酸的性质及代谢

1．1．2 色氨酸的合成

1．1．3 色氨酸的代谢

1．2 色氨酸与AHR

1．2．1 AHR的结构和功能

1．2．2 色氨酸代谢物与AHR

1．3 L-氨基酸氧化酶的性质与功能

1．3．2 LAAO酶的表达与功能

1．3．3 LAAO酶在药理学上的应用

1．3．4 IL4il与免疫系统

1．4 研究的目的及意义

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．6 商品化IL4il基因表达载体

2．2．8 瞬时转染重组293t PTT3-IL4il细胞的构建

2．2．9 稳定转染重组293t PTK-IL4il细胞的构建

2．2．10 蛋白分子免疫印迹实验

2．2．11 LAAO酶体外实验

2．3．1 重组细胞的LAAO蛋白表达

2．3．2 LAAO酶活

2．4 结果讨论

2．5 本章小结

第三章 LC／MS-MS检测方法的建立

3．1 前言

3．2 FICZ质谱检测方法的建立

3．2．2 实验结果

3．2．3 结果讨论

3．3．2 实验结果

3．3．3 结果讨论

3．4 色氨酸、犬尿氨酸、犬尿酸检测方法的建立

3．4．1 材料和方法

3．4．2 实验结果

3．4．3 结果讨论

3．5 本章小结

第四章 对LAAO酶催化代谢色氨酸产生FICZ的研究

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．4 仪器与设备

4．2．9 荧光色素酶表达的测定

4．3．2 单独引入色氨酸不是FICZ产生的唯一条件

4．3．3 LAAO酶催化条件的优化

4．4 结果讨论

4．5 本章小结

第五章 LAAO酶代谢色氨酸产生吲哚甲醛和吲哚乙酸的研究

5．1 前言

5．2 材料和方法

5．2．3 细胞系

5．2．8 色氢酸代谢物数据库的建立

5．2．9 对色氨酸代谢物的定量

5．2．10 数据处理

5．3 实验结果

5．3．1 非靶向代谢组学对LAAO酶代谢产物的分析

5．3．3 重组细胞对色氨酸的消耗

5．3．4 重组细胞代谢色氨酸产生吲哚甲醛的水平

5．3．5 重组细胞代谢色氨酸产生吲哚乙酸的水平

5．4 结果讨论

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历