基于寡核苷酸信号放大的有机磷农药多残留荧光免疫分析方法研究

摘要

农药残留受到各国政府与消费者关注，其检测技术已受到越来越多的重视。因此，建立有效的农药残留检测方法，特别是灵敏、准确、快速、简便的检测方法，对保护生态环境、消费者健康具有重要意义。
　　本研究以间接竞争免疫分析为基础，结合胶体金和寡核苷酸链信号放大技术，荧光标记寡核苷酸链探针提供检测信号，先后建立了针对三唑磷农药单残留和三唑磷、对硫磷、毒死蜱农药多残留检测的寡核苷酸信号放大免疫分析方法。主要内容如下:
　　采用柠檬酸钠还原法，合成了粒径均一、形状规则、分散性良好、浓度约为99nM的胶体金。将农药单克隆抗体和荧光标记的寡核苷酸链标记在胶体金表面，对标记过程的稳定剂浓度、老化时间、抗体浓度、寡核苷酸序列等条件进行优化，得到寡核苷酸荧光探针。
　　利用间接竞争模式，建立了基于寡核苷酸信号放大的三唑磷农药荧光免疫分析方法，并对方法的分析条件如探针与半抗原的工作浓度、二硫苏糖醇(DTT)工作条件、甲醇浓度等进行了优化。方法在001-20μg L-1范围内线性关系良好，检出限为6ng L-1。利用本方法进行了水、大米、黄瓜、甘蓝和苹果基质添加回收试验。方法的平均回收率为850％-1103％，相对标准偏差为94％-174％。进一步将该方法与三唑磷的ELISA、LC-MS/MS分析方法进行了比较和确证。结果表明，该方法准确性好、灵敏度高，满足农产品中三唑磷农药残留分析要求，可用于实际样品检测。
　　在三唑磷农药分析方法基础上，建立了基于寡核苷酸信号放大的三唑磷、对硫磷和毒死蜱农药多残留荧光免疫分析方法。在7种荧光标记物中筛选出3种荧光强度高、激发与发射波长交叉少的荧光物质作为寡核苷酸链标记物，即6-FAM、Cy3和Texas red，并研究了3种探针与3种包被半抗原之间的交叉反应，进一步优化了对硫磷、毒死蜱探针和半抗原的工作浓度。结果表明，3种探针与3种包破半抗原之间特异性良好，三唑磷、对硫磷和毒死蜱分别在001-20μg L-1、005-50μg L-1、05-1000μg L-1范围内线性关系良好，检出限分别为0007μg L-1、0009μg L-1、0087μg L-1。在自来水、大米、小麦、黄瓜、甘蓝和苹果基质中进行了添加回收试验，并用LC-MS/MS确证。方法的平均回收率为777％-1136％，相对标准偏差为71％-171％，与LC-MS/MS结果相近，表明该方法灵敏度高，准确可靠，能满足农产品中三唑磷、对硫磷和毒死蜱农药多残留分析要求，可为其它小分子化学污染物多残留分析提供借鉴。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 农药残留概述

1．1．2 农药多残留检测技术

1．2 胶体金研究进展及应用

1．3 信号放大技术

1．3．1 酶催化

1．3．2 生物素-亲和素

1．3．3 纳米材料

1．3．4 寡核苷酸链

1．4 本课题研究目的与研究内容

1．4．2 本课题研究内容

第二章 寡核苷酸荧光探针的制备与表征

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料与方法

2．2．2 胶体金的制备

2．2．3 寡核苷酸荧光探针的制备

2．3 结果和讨论

2．3．1 胶体金的制备与表征

2．3．2 寡核苷酸荧光探针的制备与表征

2．4 结论

第三章 基于寡核苷酸信号放大的三唑磷农药荧光免疫分析方法研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与仪器

3．2．2 样品前处理

3．2．5 LC-MS／MS方法建立

3．3 结果和讨论

3．3．1 免疫分析条件的优化

3．3．2 基于寡核苷酸信号放大的三唑磷农药荧光免疫分析方法建立

3．3．3 酶联免疫方法建立

3．3．4 LC-MS／MS方法建立

3．3．5 方法比较

3．4 结论

第四章 基于寡核苷酸信号放大的有机磷农药多残留荧光免疫分析方法研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．2 样品前处理

4．2．4 基于寡核苷酸信号放大的有机磷农药多残留荧光免疫分析方法建立

4．2．6 添加回收试验

4．3 结果和讨论

4．3．1 三种农药寡核苷酸荧光探针的制备

4．3．2 基于寡核苷酸信号放大的有机磷农药多残留荧光免疫分析方法建立

4．3．3 LC-MS／MS方法建立

4．3．4 添加回收试验

4．3．4 方法比较

4．4 结论

第五章 全文结论

5．1 论文总结

5．2 工作创新点

5．3 研究工作展望

参考文献

致谢

作者简历