东方田鼠血清补体杀伤日本血吸虫童虫效果和机制研究

摘要

血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病，在我国日本血吸虫病流行区钉螺分布面积仍较大，部分流行区仍存在一定数量的血吸虫病传染源，血吸虫病流行与传播的客观因素以及疫情反复与回升的风险因素依然存在。目前唯一大规模使用的治疗药物吡喹酮不能解决重复感染的问题，新药和疫苗的研制仍是该病研究的重点。东方田鼠是迄今为止发现的唯一一种具有天然抗日本血吸虫病特性的哺乳动物，其抗病机制研究可为血吸虫防控技术研究提供新方向。
　　本文应用胸主动脉灌注和组织培养法比较了东方田鼠和BALB/c鼠感染日本血吸虫尾蚴后1d，3d，8d,12d和15d的感染部位皮肤、肺脏和肝脏等处的童虫回收情况，结果两种宿主感染尾蚴后不同时间点虫体总回收率差异较大，东方田鼠为15.04％，7.05％，8.33％，0.48％，0.72％，均低于小鼠的39.24％，38.56％，46.17％，19.02％，43％。结果表明东方田鼠体内日本血吸虫童虫消亡主要发生感染后的皮肤期和肝期。表观病理观察表明，东方田鼠肝脏在感染后10d可见明显的白色异物性包囊，感染后14d该类包囊依然存在，至感染后21d异物性包囊消失，小鼠则始终未见该类异物性包囊出现。组织病理观察表明，东方田鼠感染后10-14d肝血管内可见寄生虫栓子，周围炎细胞浸润，形成嗜酸性脓肿，肝细胞多发灶性坏死，小鼠肝脏病变不明显。血常规分析结果表明，东方田鼠在感染后1-16d白细胞显著升高，白细胞5种分类结果显示主要是中性粒细胞升高。血清生化分析显示，血清白蛋白ALB、HDL-C在感染后升高。东方田鼠血清补体活性CH50为512U/mL，应用RT-PCR和ELISA检测了东方田鼠和BALB/c鼠的补体相关分子C3，C9，CD59和DAF的表达水平，结果小鼠各指标变化不明显，东方田鼠感染后8dC3，C9和CD59转录水平显著升高，DAF感染后12d转录水平显著升高。
　　体外杀虫试验结果显示，东方田鼠正常血清和灭活补体血清孵育的日本血吸虫童虫死亡率分别为85.50％±7.15％和60.99％±8.61％，差异显著(p＜0.001)，扫描电镜观察到二者孵育的童虫体表完整性存在差异，表明东方田鼠补体对日本血吸虫童虫具有显著杀伤效果。利用C1qBP蛋白抑制东方田鼠C1q的血清孵育童虫死亡率显著低于正常血清(P＜0.001)，而用50℃热灭活东方田鼠血清补体B因子孵育的童虫死亡率没有显著变化，结果表明补体经典途径可能在东方田鼠对童虫杀伤中发挥了重要作用。在体内抑制试验中，注射CVF和PBS对照组的东方田鼠在感染后8d的虫体回收率分别为23.20％和8.54％，15d为1.18％和0.42％，结果表明利用CVF抑制补体后童虫回收率显著提高。
　　筛选设计了3条东方田鼠C5基因特异的RNA干扰靶序列，构建了相应的重组RNA干扰慢病毒。LV2重组慢病毒在体外培养的东方田鼠腹腔巨噬细胞中诱导了C5基因转录下降25.76％，为进行东方田鼠RNA干扰活体试验提供了基础。
　　综上所述，东方田鼠体内日本血吸虫童虫消亡主要发生感染后皮肤期和肝期，补体在抗感染中发挥了重要作用，经典途径是补体杀伤童虫的重要机制，研究结果为阐明东方田鼠补体抗日本血吸虫特性中的作用和机制提供数据。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 东方田鼠抗日本血吸虫病现象及特点

1．3 东方田鼠抗日本血吸虫机制研究

1．3．1 东方田鼠抗血吸虫相关基因研究

1．3．2 东方田鼠血清抗血吸虫研究

1．3．3 东方田鼠血清补体抗血吸虫研究

1．4 小结

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 生物材料

2．2．2 主要仪器

2．2．3 试剂

2．3 实验方法

2．3．1 东方田鼠体内感染日本血吸虫童虫回收方法

2．3．2 感染血吸虫前后宿主组织病理观察

2．3．3 感染血吸虫前后宿主血细胞测定

2．3．4 感染血吸虫前后宿主血清生化测定

2．3．5 荧光定量PCR分析补体相关因子的转录水平

2．3．6 血清总补体溶血活性(CH50)测定

2．3．7 ELISA法测定血清C3、C4含量

2．4 实验结果

2．4．1 东方田鼠和BALB／c鼠感染日本血吸虫后虫体回收比较

2．4．2 感染血吸虫前后宿主肺和肝的病理观察

2．4．3 感染血吸虫前后宿主血细胞变化

2．4．4 感染血吸虫前后宿主血清生化指标变化

2．4．5 两种宿主感染日本血吸虫前后补体转录水平变化

2．4．6 东方田鼠血清补体活性变化

2．4．7 血清生化检测两种宿主感染血吸虫前后补体含量变化

2．4．8 ELISA检测两种宿主感染日本血吸虫前后补体含量变化

2．5 讨论

第三章 东方田鼠血清补体对日本血吸虫童虫杀伤机制研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 宿主血清杀伤日本血吸虫童虫

3．3．2 扫描电镜观察日本血吸虫童虫体被变化

3．3．3 免疫荧光检测补体沉积

3．3．4 CVF抑制东方田鼠补体后童虫回收

3．4 实验结果

3．4．1 两种宿主血清杀伤日本血吸虫后童虫差异

3．4．2 东方田鼠血清经典途径激活杀伤日本血吸虫童虫研究

3．4．3 东方田鼠血清替代途径激活杀伤日本血吸虫童虫研究

3．4．4 扫描电镜观察血清孵育日本血吸虫童虫体被变化

3．4．5 免疫荧光检测童虫表面的补体沉积

3．4．6 CVF抑制东方田鼠补体后童虫回收率比较

3．4．7 CVF抑制东方田鼠补体研究杀伤日本血吸虫效果

3．5 讨论

第四章 东方田鼠C5干扰慢病毒的构建及干扰效果评价

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂

4．3 实验方法

4．3．1 东方田鼠C5基因片段的克隆

4．3．2 生物信息学分析

4．3．3 C5 siRNA序列设计与慢病毒包装

4．3．4 东方田鼠腹腔巨噬细胞提取

4．3．5 C5RNAi重组慢病毒感染东方田鼠腹腔巨噬细胞

4．3．6 qPCR检测C5转录水平

4．4 实验结果

4．4．1 东方田鼠C5基因生物信息学分析和片段克隆

4．4．2 东方田鼠腹腔巨噬细胞培养

4．4．3 C5慢病毒感染东方田鼠腹腔巨噬细胞效果评价

4．4．4 qPCR检测C5转录水平

4．5 讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简历