麦长管蚜气味结合蛋白原核表达及结合特性分析

摘要

麦长管蚜Sitobion avenae(Fabricius)是我国小麦主产区麦蚜的优势种，以取食小麦植株汁液，传播植物病毒，分泌蜜露等方式，严重影响小麦的产量和品质。在麦长管蚜寄主搜寻、选择、定位和定殖的过程中，嗅觉扮演重要角色。信息素能引发蚜虫多种行为反应，蚜虫报警信息素在调控植物与蚜虫，以及植物-蚜虫-天敌多营养级之间互作关系中起着非常重要的作用，其中E-β-法昵烯(EBF)是蚜虫报警信息素主要或唯一组份。在蚜虫感知外周信号机制研究方面，气味结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)是研究的热点。存在于昆虫触角淋巴液中的气味结合蛋白(OBPs)是识别外周气味物质过程中的关键蛋白。目前，麦蚜气味结合蛋白OBPs与EBF结合特征还不够清楚。因此，本研究以麦长管蚜气味结合蛋白识别EBF为重点，利用基因克隆，重组表达载体构建，重组蛋白原核表达与纯化，采用荧光竞争结合实验筛选与气味分子特异结合的麦长管蚜气味结合蛋白。取得的主要结果如下
　　1、基于麦长管蚜触角转录组注释信息，获得12个麦长管蚜气味结合蛋白SaveOBPs基因(SaveOBP1-10、SaveOBP14/15)，通过基因克隆和测序验证了这12个SaveOBPs基因的表达。
　　2、构建12个SaveOBPs表达质粒，并在大肠杆菌中诱导表达出重组蛋白。8个SaveOBPs重组蛋白获得纯化，其中SaveOBP1/3/6/7/8/9/14等7个SaveOBPs采用离子交换层析技术的方法成功纯化，而SaveOBP10则采用金属镍亲和层析技术对包含His标签的融合蛋白成功纯化，首次在麦长管蚜中纯化出SaveOBP1/6/9/10/14。纯化的蛋白均通过质谱LC-MS/MS(Q-TOF)鉴定为麦长管蚜气味结合蛋白。
　　3、利用荧光竞争结合实验探究SaveOBPs与蚜虫报警信息素组份、小麦挥发物组份、蚜虫性信息素组份、EBF及类似物的结合特性。结果发现在与蚜虫报警信息素组份识别中首次发现SaveOBP9与EBF强烈结合(竞争解离常数Ki值＜10μM);SaveOBP3/7/9均与EBF强烈结合，K1值分别为455±032μM，065±003μM，060±003μM，我们推测SaveOBP3/7/9可能是麦长管蚜识别EBF的靶标蛋白。此外，SaveOBP9也与蚜虫报警信息素次要组份α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯强烈结合，SaveOBP7与蚜虫报警信息素组份β-蒎烯、柠檬烯强烈结合。在与小麦挥发物结合特性中发现SaveOBP9与小麦挥发物组份顺-3-己烯醇，顺-3-己烯醇乙酸酯，水杨酸甲酯，α-松油醇强烈结合，表明SaveOBP9可能是识别小麦挥发物的一种靶标蛋白。在识别蚜虫信息素的结合特性研究中发现，SaveOBP7/9与蚜虫性信息素组份荆芥醇和荆芥内酯强烈结合，SaveOBP3与S aveOBP10蚜虫性信息素组份较强结合(Ki＜20μm)，推测SaveOBP3/7/9/10可能是麦长管蚜识别蚜虫性信息素组份的靶标蛋白。
　　4、通过荧光竞争结合实验，从38个新型EBF类似物中筛选出16个与SaveOBPs结合活性较强的新型EBF类似物，分别为CAU-Ⅱ-09，CAU-Ⅱ-11，CAU-Ⅱ-15，CAU-Ⅱ-19，CAU-Ⅱ-20，CAU-Ⅱ-21,CAU-Ⅱ-28,CAU-Ⅱ-29,CAU-Ⅰ-B2,CAU-Ⅳ-02,CAU-C-03,CAU-A-01,CAU-A-02,CAU-A-03，CAU-A-04，CAU-A-05-2。特别的是，这些新型EBF类似物与SaveOBP3/7/9表现出强烈的结合特性。
　　上述研究结果为解析EBF对麦蚜驱避调控的分子机理，丰富蚜虫化学生态学理论具有较重要的意义，并为进一步开发以EBF为导向的驱避剂，研发蚜虫绿色防控技术提供参考依据。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 昆虫嗅觉信号转导机制

1．2．昆虫OBPs研究进展

1．2．1 昆虫OBPs一般特征

1．2．2 昆虫OBPs种类及表达分布

1．2．3 昆虫OBPs的功能研究

1．2．4 昆虫OBPs三维结构与功能特性研究

1．3 蚜虫识别气味分子特性研究进展

1．3．1 识别蚜虫报警信息素及其类似物

1．3．2 EBF及类似物作用

1．3．3 蚜虫对植物挥发物及性信息素的识别特性

1．4 研究目的和意义

1．5 研究内容

第二章 麦长管蚜气味结合蛋白基因克隆

2．1．3 主要试剂

2．2．2 第一链cDNA合成

2．2．3 SaveOBPs引物的设计与合成

2．2．4 PCR扩增SaveOBPs

2．2．5 PCR扩增产物胶回收

2．2．7 克隆菌株阳性克隆鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 RNA样品检测

2．3．2 SaveOBPs PCR扩增

2．3．3 PCR扩增产物胶回收

2．3．4 克隆菌株阳性克隆鉴定

2．4 结论与讨论

第三章 麦长管蚜气味结合蛋白原核表达及纯化

3．1．2 主要试剂及溶液

3．1．3 仪器设备

3．2．3 胶回收酶切片段

3．2．5 表达菌株阳性克隆鉴定

3．2．8 SaveOBPs重组蛋白大量表达

3．2．9 SaveOBPs重组蛋白纯化

3．2．10 蛋白浓度测定及鉴定

3．3．1 质粒酶切结果与分析

3．3．2 重组质粒阳性鉴定

3．3．2 SaveOBPs重组蛋白小量诱导表达结果分析

3．3．3 SaveOBPs重组蛋白大量表达与纯化结果分析

3．3．4 SaveOBPs重组蛋白浓度测定结果分析

3．3．5 SaveOBPs重组蛋白质谱鉴定结果分析

3．4 本章小结与讨论

第四章 麦长管蚜气味结合蛋白结合特性研究

4．1 实验材料

4．1．3 主要仪器

4．2．2 EBF类似物竞争结合实验

4．2．3 配体竞争结合实验

4．3 结果与分析

4．3．1 荧光探针饱和结合实验

4．3．2 EBF类似物竞争结合实验结果分析

4．3．3 配体竞争结合实验结果分析

4．4 结论与讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历