油菜粒重基因BnC08.JAZ1-1功能的初步解析

摘要

粒重是油菜产量构成因子和育种目标性状之一。在油菜种质资源中，粒重呈现很大的自然变异（千粒重2-8克），其中蕴含着丰富的大粒等位基因。但是，油菜粒重自然变异的调控基因和机制基本上不清楚，这极大的限制了油菜粒重的改良和产量的进一步提高。因此，发掘调控油菜粒重的关键基因并深入研究其分子机理，可以为培育大粒和高产品种提供理论指导和技术支撑。
　　本课题前期利用油菜测序品种中双11号和No.73290构建的BnaZNF2群体及相应的F23和F24家系定位到几个可重复的粒重QTL。随后，对F6代粒重极端RIL株系（千粒重＜3克和＞6克）花后25天的种子混合样进行了转录组测序和表达谱分析。结合QTL定位和基因差异表达分析的结果，在qSW C08置信区间内筛选到一个新的粒重候选基因（Bna085006）。本研究利用拟南芥对Bna085006进行了初步的功能验证，所获得主要研究结果及结论如下:
　　1.生物信息学分析结果表明Bna085006和拟南芥JAZ1基因高度同源(氨基酸序列相似度73.23％)，编码一个定位于细胞核的转录因子，参与茉莉酸信号途径。JAZ1在白菜(A06，A08和A09各一个)和甘蓝（C05一个，C08两个）中分别有3个拷贝，而在甘蓝型油菜中恰好有6个拷贝。因为Bna085006应该来源于C08染色体，故命名为BnC08.JAZ1-1。
　　2.克隆亲本中双11号中BnC08.JAZ1-1基因的CDS序列，构建超表达载体转化拟南芥。和对照相比，T2代十几个转基因阳性株系的粒重显著增加，其中一个增幅在20％左右。细胞学观察表明该株系种子变大的原因是细胞数目显著增多，而细胞大小没有变化。
　　3.利用GUS染色分析BnC08.JAZ1-1时空表达模式，发现BnC08JAZ1-1主要在幼嫩花瓣中表达且随着成熟度逐渐降低，而在叶片、茎、角果皮和种子未观察到GUS信号。推测BnC08.JAZ1-1基因的表达水平可能与器官的发育程度有关。
　　4.利用35S.目标基因+GFP融合蛋白观察BnC08JAZ1-1在烟草叶片中的亚细胞定位，结果表明BnC08JAZ1-1基因定位在细胞核。
　　5对超表达和野生型株系花后15天的种子进行转录组分析，筛选到582个差异表达基因，显著富集于植物-病原互作、泛素介导的水解以及昼夜节律途径。其中，泛素-蛋白酶体降解途径和种子大小调控密切相关。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．2 植物种子大小／重量的复杂性

1．3 已知的植物种子大小／重量基因及其调控途径

1．3．1 泛素-蛋白酶体降解途径

1．3．2 植物激素途径

1．3．3 G蛋白信号途径

1．3．4 CYP450途径

1．3．5 转录因子途径

1．3．6 IKU途径

1．4 油菜粒重的遗传学研究进展

1．4．1 传统数量遗传学

1．4．2 QTL定位

1．4．3 基因克隆

1．5 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 生物信息学分析

2．2 超表达载体构建

2．2．1 实验材料

2．2．2 RNA提取和反转录cDNA

2．2．3 PCR扩增和切胶回收

2．2．4 与pMD18T的连接与转化

2．2．5 超表达载体的构建

2．2．6 双酶切反应

2．2．7 连接与转化

2．2．8 质粒提取

2．3 拟南芥遗传转化

2．3．1 农杆菌转化(热激法)

2．3．2 拟南芥浸染(花序侵染法)

2．4 转基因株系的筛选与鉴定

2．4．1 实验试剂

2．4．2 转基因株系的筛选

2．4．3 转基因株系的鉴定

2．5 种子的细胞学观察

2．5．1 实验材料

2．5．3 试验方法

2．6 启动子分析载体的构建

2．6．1 实验材料

2．6．2 DNA提取

2．6．3 PCR扩增与切胶回收

2．6．5 双酶切反应

2．6．6 连接与转化

2．7 转基因拟南芥的GUS组织化学染色

2．7．1 GUS染色所需的主要试剂

2．7．2 GUS组织化学染色

2．8 亚细胞定位

2．8．1 激活缓冲液的配制方法

2．8．2 农杆菌侵染液的准备

2．8．3 烟草侵染

2．9 拟南芥种子转录组测序

2．9．1 实验材料

2．9．2 RNA提取

2．9．3 转录组测序文库构建与测序

第三章 结果与分析

3．1．2 BnC08．JAZ1-1蛋白的结构特征分析

3．1．3 BnC08．JAZ1-1蛋白的系统进化分析

3．2 BnC08．JAZ1-1超表达株系种子的细胞学观察

3．3 BnC08．JAZ1-1基因的时空表达模式

3．3．2 BnC08．JAZ1-1的GUS组织化学定位

3．4 BnC08．JAZ1-1的亚细胞定位

3．5 BnC08．JAZ1-1超表达拟南芥株系种子的转录组分析

第四章讨论与小结

参考文献

附录

致谢

作者简历