奶牛生殖道益生性乳酸菌分离鉴定及其复合制剂的研究

摘要

奶牛生产后如未清除细菌污染物可引起奶牛子宫内膜炎，该疾病会严重危害奶牛生产性能、减少奶牛使用年限而造成重大经济损失。益生菌是一种来源于生物机体、绿色健康无污染的活性微生物，因其能更好作用于生物机体，现已成为研究的的热点，是防治细菌性疾病的新方向。乳酸菌是一种常见益生菌，常见于肠道，是调节机体胃肠道正常菌群。乳酸菌能够促进机体微生态平衡，其生理功能与机体生命活动息息相关。应用乳酸菌治疗人类消化道和生殖道疾病已见于临床报道，但其用于防治奶牛子宫内膜炎的研究较少。本研究主要筛选了能够用于防治奶牛子宫内膜炎的乳酸菌菌株，并对菌株及其制剂进行了功能特性研究和安全性评价。主要结果如下:
　　1.奶牛源益生乳酸菌分离鉴定
　　从产后30～50天健康奶牛子宫颈口采集的黏液中分离纯化得到乳酸菌，并通过生化鉴定和分子生物学鉴定技术对分离菌株进行鉴定。结果显示:25份样品中共得到13株乳酸菌株。经上清抑菌试验和细胞黏附试验最终筛选出2株兼具良好抑菌活性和优良细胞黏附能力的“益生菌”乳酸菌株。
　　2.乳酸菌制剂制备及特性研究
　　通过混合不同乳酸菌株，组合抑菌试验找到最佳的抑菌组方;经伊红美兰平板试验表明乳酸菌株与大肠杆菌之间存在竞争抑制或拮抗作用;通过热稳定性试验、胰蛋白酶试验、过氧化氢酶试验、调节pH等试验等分析乳酸菌主要抑菌成分和最佳培养温度。结果显示:鼠李糖乳杆菌主要抑菌成分为细菌素等蛋白类物质和过氧化氢，其最适培养温度为39℃，具有较强的产酸能力;魏斯氏细菌主要抑菌成分为有机酸、过氧化氢和细菌素，其最适合培养温度为39℃，产酸能力较强;粪肠球菌主要抑菌成分为有机酸，其最适温度为37℃，产酸能力低于其他两株菌株。
　　3.菌株及其制剂安全性评价
　　通过将乳酸菌小鼠腹腔注射和家兔阴道灌注，以受试动物精神状态、体温等临床表现及脏器等病理变化进行安全性评价。结果显示:单菌及复合乳酸菌株接种均对小鼠组织器官无安全性影响，也未引起家兔阴道明显炎症反应。筛选乳酸菌株及制剂可以用于下一步临床试验。

目录

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摘要

第一章 引言

1．1 益生性乳酸菌及其作用机制

1．1．1 酸性物质的产生

1．1．2 过氧化氢的产生

1．1．3 抗菌蛋白的产生

1．1．4 竞争和黏附的作用

1．1．5 免疫反应的影响

1．2 乳酸菌在奶牛生殖系统疾病防治中的研究

1．3 展望

第二章 健康奶牛子宫颈益生性乳酸菌分离、筛选及抑菌活性分析

2．1 试验材料

2．1．1 样品来源

2．1．3 仪器与设备

2．2 测定指标与方法

2．2．1 样品采集与增菌培养

2．2．2 乳酸菌的分离和纯化

2．2．3 革兰氏染色和镜检

2．2．4 生化鉴定

2．2．5 乳酸菌DNA的提取

2．2．6 乳酸菌16S rDNA扩增

2．2．7 16S rDNA序列测定及分析

2．2．8 乳酸菌抑菌试验

2．2．9 细胞黏附实验

2．3 结果与分析

2．3．1 分离乳酸菌菌株格兰氏染色镜检图片

2．3．2 生化鉴定结果

2．3．3 16S rDNA基因扩增结果

2．3．4 测序结果在线比对表

2．3．5 抑菌试验结果

2．3．6 细胞黏附试验结果

2．4 讨论

2．4．1 奶牛子宫炎益生性细菌的分离鉴定

2．4．2 乳酸菌上清液抑菌和细胞黏附试验

2．5 结论

第三章 单个菌株及其复合制剂的功能特性研究

3．1 试验材料

3．1．1 试验菌株

3．1．2 试验试剂

3．1．4 试验仪器

3．2 试验方法

3．2．1 菌株活化

3．2．2 菌株的复合抑菌试验

3．2．5 有机酸类排除试验

3．2．6 过氧化氢排除试验

3．2．7 细菌素等肽类排除试验

3．2．8 菌株生长曲线的测定

3．2．9 菌株产酸能力的测定

3．3 试验结果

3．3．1 复合菌株抑菌试验结果

3．3．2 大肠杆菌竞争试验结果

3．3．3 热稳定试验结果

3．3．4 有机酸类排除试验结果

3．3．5 过氧化氢排除试验结果

3．3．6 细菌素等类排除试验结果

3．3．7 菌株温度对生长曲线影响的测定

3．3．8 菌株产酸能力的测定

3．4 讨论

3．4．1 复合菌株试验

3．4．3 抑菌成分试验

3．4．4 生长曲线与产酸能力

3．5 小结

第四章 单个菌株及其复合菌株安全性研究

4．1 试验材料

4．1．1 试验菌株

4．1．2 试验动物

4．1．3 试验试剂和器材

4．2 试验方法

4．2．1 生物安全性试验

4．2．2 小鼠安全性研究

4．2．3 家兔阴道灌注

4．3 试验结果

4．3．1 小鼠安全性试验

4．3．2 兔子安全性试验

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历