PRRSV感染下调猪肺泡巨噬细胞清道夫受体A表达的机制研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是危害我国养猪业的头号元凶，给我国养猪业造成巨大的经济损失。现如今，虽然疫苗的使用使得PRRSV感染引发的爆发流行得以控制，但在临床上PRRSV与细菌等微生物共感染的现象非常普遍。然而，到目前为止，其具体的机制还不清楚。
　　在肺部，猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAM)是PRRSV感染的靶细胞。已有的研究显示，PRRSV感染可破坏PAM介导的先天性免疫防御包括对入侵病原菌的吞噬。巨噬细胞A类清道夫受体(Scavenger Receptor，SR)如SRA和MARCO，作为一类重要的先天性免疫受体，介导对多种病原菌的识别和吞噬，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。我们前期的研究显示猪SRA和MARCO可以介导对临床常见分离菌如金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等的吞噬。进一步，我们的前期结果显示PRRSV感染下调SRA和MARCO在PAM上的表达(mRNA水平)。因此，这些结果促使我们假想:PRRSV感染可通过下调清道夫受体SRA和MARCO的表达抑制细菌的吞噬，从而促进细菌的继发感染。本研究聚焦于PRRSV感染下调清道夫受体表达机制研究，具体如下:
　　首先，利用Western blot方法对猪不同组织中SRA和MARCO的表达情况进行了分析。在肺中，我们可以检测到SRA和MARCO的表达。但在PAM上SRA有较高水平的表达，MARCO的表达量较低，几乎检测不到其表达。
　　随后，我们对PRRSV感染下调清道夫受体表达机制进行了研究。鉴于MARCO在PAMs细胞上低水平表达，因此，我们主要聚焦于PRRSV感染下调SRA表达的机制研究。具体的研究结果为:
　　1)我们收取PRRSV感染的PAM不同时间点的mRNA和蛋白样品进行分析，结果显示PRRSV感染可通过抑制转录下调SRA的表达。
　　2)利用UV灭活的病毒作为对照，我们的研究显示PRRSV感染下调SRA的表达与病毒复制相关。
　　3)我们克隆了猪的SRA的启动子并构建表达虫荧光素酶的报告质粒，通过测定luciferase验证SRA启动子的有活性;进一步，通过缺失突变，鉴定出核心启动子区域。利用双荧光素酶报告基因检测技术，筛选到PRRSV的非结构蛋白NSP4可以抑制SRA的荧光素酶活性。进一步，我们的研究发现NSP4主要抑制其核心启动子的活性。
　　4)通过染色质免疫共沉淀方法(CHIP)验证NSP4与猪SRA启动子的相互作用，我们的研究结果发现NSP4可以与猪SRA启动子直接结合，其主要结合部位在-84到-214位置。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 猪繁殖与呼吸综合征

1．1．1 概述

1．1．5 生物学特性

1．2 猪繁殖与呼吸综合征病毒

1．2．1 概述

1．2．2 病毒基因组

1．2．3 PRRSV非结构蛋白NSP4

1．2．4 PRRSV结构蛋白N蛋白

1．2．5 PRRSV的致病机理

1．3 清道夫受体

1．3．1 概述

1．3．2 清道夫受体功能

1．3．3 SRA的功能

1．3．4 MARCO的功能

1．4 研究进展

1．5 研究目的意义

第二章 猪A类清道夫受体SPA和MARCO的表达情况分析

2．1 材料

2．1．1 实验动物，细胞

2．1．2 主要仪器与试剂

2．2 方法

2．2．1 PAM细胞分离提取

2．2．3 组织器官的分离

2．2．4 PAMs的培养以及提取蛋白

2．2．5 组织蛋白提取

2．2．6 BCA法测定蛋白浓度

2．2．7 Western blot

2．3 结果

2．3．1 不同猪组织中SRA／CD204的表达情况进行了分析

2．3．2 不同猪组织中MARCO的表达情况进行了分析

2．3．3 不同猪的PAMs上SRA以及MARCO的表达情况进行了分析

2．4 讨论

第三章 PRRSV感染通过抑制其转录下调SRA／CD204的表达

3．1 材料

3．1．1 细胞，病毒

3．1．2 主要仪器与试剂

3．2 方法

3．2．1 HP-PRRSV增殖

3．2．4 引物设计

3．2．5 RNA提取以及反转录

3．3．1 PRRSV感染PAWs后，下调SPA蛋白的表达与其转录抑制相关

3．3．2 PRRSV感染PAMs，SPA的蛋白表达下降与病毒复制相关

3．4 讨论

第四章 PRRSV感染可通过NSP4负调控SPA基因的转录

4．1 材料

4．1．1 细胞，病毒

4．1．2 主要仪器与试剂

4．2 方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 SRA启动子基因克隆

4．2．3 SRA添加酶切位点

4．2．4．真核表达质粒的构建

4．2．5．质粒转染293T细胞

4．2．6．双荧光素酶报告基因检测

4．2．7 缺失突变体的构建

4．2．8 染色质免疫共沉淀(CHIP)

4．3 结果

4．3．2 PRRSV非结构蛋白NSP4可以抑制MSR1 luciferase活性

4．3．3 MSR1启动子及缺失突变体与NSP4共转染luciferase活性分析

4．3．4 Chip PCR证明NSP4可以直接与启动子MSR1结合在-84到-214位置上

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历