红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因的定位与发掘

摘要

根结线虫(Meloidogyne spp)是影响世界作物安全生产的重要病害，同时也是造成桃树“短寿病”和“重茬病”的重要致病因素之一，其中尤以南方根结线虫(Meloidogyne incognita)危害最为广泛和严重。培育抗根结线虫桃品种是控制南方根结线虫病害的绿色安全、经济高效措施。对桃抗根结线虫基因进行全面系统研究，探索抗病基因在免疫系统中的位置和作用，为认识桃抗根结线虫的本质奠定基础。本课题组前期围绕红根甘肃桃1号(Prunus kansuensis L)抗南方根结线虫基因进行了大量的基础工作研究建立了一种快速鉴定桃对根结线虫抗性的方法，确定了桃表观形态发生变化的重要时期，利用‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’构建了桃连锁图谱，将抗根结线虫基因定位在2号染色体，完成‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’南方根结线虫侵染后各时期的转录组测序，用二代分子标记定位红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因，将抗性基因定位至NBS29(6cM)和SRAPs标记M4E11-100(20cM)之间。为更精确对红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因定位，本研究将继续进行该抗性基因的定位和发掘工作，为抗病品种的利用提供思路，同时为抗病育种工作奠定理论依据。
　　本研究首先以BC1代构建抗、感基因池进行BSA测序。而后用‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’杂交F1自交构建F2代分离群体，利用BSA测序结果以及KASP基因分型确定抗性候选位点区段，深入分析基因序列以及基因表达量，逐步发掘控制红根甘肃桃1号抗南方根结线虫的关键基因。通过以上试验，本研究初步明确了控制红根甘肃桃1号抗南方根结线虫的候选关键基因，获得的主要结果如下
　　1、利用亲本为‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’的BC1群体构建抗、感混池，以全基因组重测序为基础进行性状BSA定位，共检测到2，442，036个SNPs。筛选亲本中纯合且F1中杂合的SNP位点，共挑选出1，569，564个多态性标记。选择‘红根甘肃桃1号’作为参考亲本，分析计算两个子代池的△SNP-index。选择95％置信水平下，在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP位点，得到候选的77个多态性标记位点。
　　2、利用15个SNPs对302份F2代材料进行KASP基因分型，共获得3883个位点的基因型，占总位点数的857％。独立性检验结果表明SNP3(CHR24905737)、SNP5(CHR25397749)、SNP7(CHR25582276)与红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因相关性最高。
　　3、利用不同侵染时期的‘红根甘肃桃1号’、‘贝蕾’根部样品，对25个候选基因进行基因表达分析，结果发现关键候选基因ppa020745m在红根甘肃桃1号中随根结线虫侵染表达量升高，在侵染后12h表达量显著升高，在贝蕾中基本不表达。其上游启动子序列在抗病种质中存在一个35bp的缺失。在250个F2后代中进行验证，结果表明在86个抗病后代中该片段均缺失，115个抗病后代测序时该缺失片段处为双峰，推测该缺失片段在抗病材料中为缺失或杂合，在49个感病后代中该片段存在。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 根结线虫研究概况

1．1．3 植物根结线虫抗性

1．2 桃抗根结线虫研究进展

1．2．2 桃抗根结线虫基因

1．3 SNP技术在基因定位中的应用

1．3．2 SNP分型检测

1．4 研究目的及意义

1．5 技术路线

第二章 红根甘肃桃1号抗南方根结线虫位点的定位

2．1 试验材料

2．1．4 实验试剂

2．2 试验方法

2．2．2 基于全基因组重测序的BSA性状定位

2．2．3 KASP基因分型

2．3 结果与分析

2．3．1 F2代南方根结线虫抗性鉴定结果

2．3．2 基于全基因组重测序的BSA性状定位结果

2．3．3 KASP基因分型结果

2．4 讨论

2．4．3 KASP基因分型

第三章 红根甘肃桃1号抗南方根结线虫关键基因的发掘

3．1 试验材料

3．2．3 RNA逆转录

3．2．6 实时荧光定量PCR

3．3．1 确定关键基因

3．3．2 关键基因蛋白序列分析

3．3．3 关键基因ppa020745m早期表达分析

3．3．4 关键基因全长及启动子序列分析

3．4 讨论

第四章 全文结论

4．1 主要结论

4．3 下一步工作展望

参考文献

附录

致谢

作者简历