青枯菌copSRABCD基因簇铜抗性作用机理及表达调控研究

摘要

植物细菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由雷尔氏菌属植物致病种(Ralstonia spp.泛称青枯菌)引起的一种世界性分布的重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂，铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了铜抗性菌株。全基因组序列测定表明，青枯菌Po82菌株大质粒上普遍携带了丁香假单胞菌中的铜抗性编码基因copSRABCD的同源物。 以青枯菌Po82菌株为研究对象，通过反向遗传学的研究手段，构建copA、copD、copSR基因缺失菌株及相应互补菌株。解析了copA、copD、copSR基因与青枯菌铜胁迫应答、代谢活性、致病力和运动性等表型生物学特征之间的关系以及copSRABCD基因簇的表达调控关系。应用RNA-seq测序技术，测定Po82菌株以及copABCD基因缺失菌株在营养丰富培养条件、铜诱导培养以及寄主体内环境的转录本，发掘不同培养条件下共表达与差异表达的基因，以期探明copSRABCD基因簇的功能并发掘新的铜抗性及致病相关基因，为进一步深入解析青枯菌寄主及环境适应性进化的分子机理奠定基础。 1.铜抗性候选基因copA、copD、copSR基因功能验证 铜MIC测定结果表明Po82△copA、Po82△copD及Po82△copSR菌株的铜抗性MIC值都较野生型菌株降低。致病力测定结果表明，相较于野生型菌株，Po82△copA菌株的致病力下降，Po82△copSR菌株的致病力增强，而Po82△copD菌株的致病力没有显著差异。生长曲线结果表明，在铜胁迫的环境中，copA、copD缺失菌株影响青枯菌的生长速率。运动性测定结果表明，copA基因与青枯菌的运动能力无关，copD、copSR基因的缺失影响青枯菌的运动能力。并且copA的缺失导致青枯菌对α-D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源，L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代谢利用速率降低。 2.铜抗性基因簇表达调控测定 qRT-PCR结果显示copSRABCD基因簇的表达受到铜离子的诱导，copABCD基因的表达量随着CuSO4浓度的增加而增加，证实了该基因簇为诱导型表达。RT-PCR结果显示，copABCD为同一转录单位，copSR为同一转录单位。通过测定copSR基因缺失菌株中copABCD基因的表达模式，明确了copSR对copABCD基因的调控方式为负调控。 3.青枯菌离体与体内转录组学研究 研究明确了离体培养条件下，亚抑制铜浓度水平诱导不仅可正调控Po82和Po82△copABCD菌株铜抗性相关基因的表达，相当数量的致病相关基因的表达也显著上调。上调表达的致病相关基因大部分为hrp基因簇的组成基因和Ⅲ型效应子(T3Es)编码基因。此外，离体铜诱导培养条件下，Po82和Po82△copABCD菌株中的czcABC、fur、marR等重金属和抗生素调控基因的表达量显著上调。在寄主体内环境中，copABCD基因簇缺失菌株上调表达Ⅳ型菌毛编码基因及致病相关基因。转录组测序结果为进一步明确copSRABCD基因簇的功能并发掘新的铜抗性及致病相关基因奠定基础。