日本血吸虫N--乙酰转移酶13的初步生物学特性研究

摘要

N-乙酰转移酶13（N-acetyltransferase13，NAT13）别名Nα-乙酰转移酶50，是在有丝分裂过程中，染色体分裂时所需要的一种Nα-末端乙酰转移酶，本研究对日本血吸虫NAT13(SjNAT13)在日本血吸虫中的生物学特性及相关功能进行了初步研究。 根据GenBank中日本血吸虫NAT13基因的cDNA序列(FN317573.1)设计引物，成功克隆表达了SjNAT13基因，该基因全长为621bp，编码206个氨基酸，重组SjNAT13蛋白(rsjNAT13)分子量大小为27kDa。利用实时定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)分别检测了该基因在虫体不同发育时期及雌、雄虫中的转录水平，结果表明，其在日本血吸虫的不同发育阶段均有转录，在21d虫体中的转录水平最高，14d虫体中的转录水平最低;雌雄虫转录水平比较结果表明，在21d雌雄虫中转录水平相当，17d、24d、28d、35d和42d雄虫中的转录水平显著高于雌虫。 分别将rSjNAT13和日本血吸虫42d全虫可溶性蛋白作为检测抗原，以抗rSjNAT13的小鼠血清为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG为二抗，进行Western blotting分析，结果显示，rsjNAT13和虫体蛋白可以被制备的抗rsjNAT13血清识别。将rsjNAT13免疫BALB/c小鼠进行免疫保护实验，两次动物保护实验的结果显示，与PBS对照组相比，rSjNAT13实验组在BALB/c小鼠体内分别诱导产生12.30％(P＞0.05)和16.36％(P＞0.05)的减虫率和24.23％(P＜0.05)和24.47％(P＜0.05)每条雌虫的肝脏减卵率，该重组蛋白不能够诱导产生较好的减虫效果，但可以减少每对虫体的产卵量。利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测三组小鼠在免疫前后的特异性IgG抗体水平变化，结果显示，rsjNAT13组小鼠在第二次免疫后，体内rsjNAT13特异性IgG抗体水平显著升高，在三免时达到最高，206佐剂组和PBS组在感染前后及剖杀时都没有明显变化。将28d虫体进行免疫组化实验，观察该蛋白在虫体中的分布情况，结果显示，该蛋白在虫体中广泛分布。 通过电转法对42d成虫进行体外RNA干扰实验，经qPCR检测及筛选，发现siRNA-514具有较好的干扰效果，利用siRNA-514对42d成虫进行体外RNA干扰后，计算干扰后虫体的减卵率，结果显示，与空白对照组相比，siRNA-514干扰组产生了38.91％(P＜0.05)的减卵率;将siRNA-514尾静脉注射感染18d后的BALB/c小鼠，进行体内RNA干扰实验，结果显示，与空白对照组相比，siRNA-514干扰组产生了10.91％(P＞0.05)的减虫率和37.66％(P＜0.05)的每条雌虫的肝脏减卵率。 本研究成功克隆、表达了SjNAT13基因，并对该重组蛋白进行了小鼠免疫保护实验的效果评估，检测了该基因在虫体不同发育阶段、不同性别虫体中的表达情况，并对该基因进行了体外和体内RNA干扰效果进行了评估。本研究为更好地了解SjNAT13的基本特性、探究SjNAT13在日本血吸虫中的生物学功能，特别是对虫体产卵的影响奠定基础。