西瓜果肉硬度和酸味性状的转录组分析及主效基因的精细定位

摘要

果肉硬度和果实有机酸含量是决定西瓜果肉质地和果实风味等感官品质的重要因素，是由多基因控制的复杂数量性状。传统的生理与遗传学研究方法对复杂性状的遗传本质和分子调控机制研究存在一定的局限性，进一步明确西瓜果肉硬度和果实有机酸积累的关键调控因子，可以为西瓜品质育种提供理论与技术支持。本文以野生西瓜PI271769为供体亲本，栽培种西瓜203Z为轮回亲本，分子标记结合成熟果实的表型鉴定，通过连续回交和自交创制了果肉硬度和果实酸味的近等基因系材料。通过对西瓜果实发育期的RNA样品进行比较转录组分析，BSA-Seq结合构建的分离群体对西瓜果肉硬度和酸味性状的主效基因进行精细定位研究，获得的主要结果如下:
　　1.创制西瓜果肉硬度和酸味性状的近等基因系。通过连续7代回交和4代自交，创制了有关西瓜果肉硬度的近等基因系HWF和果实酸味的近等基因系SW。与轮回亲本203Z相比，HWF果实有较高的果肉硬度，SW果实有较高的有机酸含量，除目标性状有明显差异外，其它生物学性状基本一致。
　　2.西瓜果肉不同发育时期细胞壁物质成分含量的测定与比较转录组分析。测定软果肉的203Z和硬果肉的HWF果实发育4个关键时期的果实中的细胞壁物质成分含量，发现原果胶、纤维素、半纤维素和共价结合果胶的含量变化与果肉硬度变化趋势一致，随着果肉硬度的增大而增加，而水溶性果胶和离子型果胶的含量伴随着果肉硬度下降而持续增加。比较转录组分析发现果胶酯酶、糖基转移酶、纤维素合成酶、多聚半乳糖醛酸酶和木葡聚糖内糖基转移酶基因在不同果肉硬度的材料中差异表达，可能通过对果肉细胞壁物质成分含量的影响来调节西瓜果肉硬度大小的变化。
　　3.西瓜果肉硬度主效基因的精细定位。在全基因组水平上筛选与西瓜果肉硬度紧密连锁的分子标记，结合BSA-Seq对西瓜果肉硬度的主效基因进行初步定位，在此基础上，通过构建BC7F3分离群体和衍生的F2次级分离群体，将该基因定位在西瓜6号染色体12780793-17658672的物理区间内，包含166个候选基因，其中木葡聚糖内糖基转移酶基因Cla004119和乙烯响应元件Cla004120在不同果肉硬度的材料中基因表达量差异显著，可能是控制西瓜果肉硬度的关键基因。
　　4.西瓜果实不同发育期可溶性糖和有机酸含量的测定及比较转录组分析。测定203Z和SW果实发育过程中可溶性糖和有机酸的含量，发现果实中可溶性糖的含量前者稍高于后者，差异不明显;而有机酸的含量前者低于后者，差异显著。比较转录组分析发现蔗糖合成酶、蔗糖磷酸化酶及不溶性酸转化酶基因对西瓜果实中可溶性糖的积累与代谢具有重要作用，NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）依赖的苹果酸脱氢酶和铝诱导的苹果酸转运酶基因调控果实中苹果酸的积累，而柠檬酸合成酶基因决定了果实中柠檬酸的含量。
　　5.西瓜果实酸味性状主效基因的精细定位。在BSA-Seq对西瓜果实酸味初步定位的基础上，通过构建BC7F2分离群体和衍生的F2次级分离群体，最终将该基因定位在西瓜6号染色体318Kb(4529126-4855093)的物理区间内，含有28个候选基因，结合转录组数据分析，发现仅有Cla009218和Cla009226两个基因在不同果实酸味的材料中差异表达，可能对西瓜果实中有机酸的积累起决定作用。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 果实硬度变化研究进展

1．1．1 果肉细胞壁结构组分变化

1．1．2 与果实硬度变化相关的关键酶研究

1．1．3 西瓜果肉硬度的研究

1．2 果实有机酸研究进展

1．2．1 西瓜果实有机酸研究

1．3 近等基因系的构建及应用

1．3．1 近等基因系的构建

1．3．2 近等基因系的应用

1．4 西瓜果实转录组研究进展

1．5 西瓜果实性状基因定位研究

1．6 本研究的目的和意义

第二章 西瓜果肉硬度和酸味性状近等基因系构建

2．1 材料和方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 西瓜果肉硬度测定

2．1．6 SSR标记分析

2．1．7 数据统计与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 亲本多态性引物的筛选

2．2．2 BC7F1世代西瓜硬果肉株系基因型比较分析

2．2．3 BC7F1世代西瓜果实酸味株系基因型比较分析

2．2．4 BC7F1硬果肉西瓜单株1-6基因型分析

2．2．5 BC7F1酸果肉西瓜单株3-10基因型分析

2．2．6 西瓜果肉硬度性状近等基因系构建

2．2．7 西瓜果实酸味性状近等基因系构建

2．3 讨论

第三章 西瓜果肉硬度比较转录组分析

3．1 材料和方法

3．1．3 西瓜果肉中细胞壁物质含量的测定

3．1．4 总RNA的提取与质量检测

3．1．5 cDNA文库构建、质控及测序

3．1．6 测序质量控制和转录组数据与参考基因组序列比对

3．1．10 RT-PCR反应

3．1．11 实时荧光定量(qRT-PCR)分析

3．1．12 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 西瓜果实发育过程中细胞壁物质含量的变化

3．2．2 RNA-Seq数据的综合评价

3．2．3 差异表达基因的鉴定

3．2．4 差异表达基因的GO和KEGG功能富集分析

3．2．5 西瓜果实细胞壁物质成分相关基因的表达分析

3．2．6 qRT-PCR验证转录组数据的准确性

3．3 讨论

3．3．1 细胞壁物质成分含量对西瓜果肉硬度的影响

3．3．2 西瓜果实细胞壁物质合成相关基因的研究

第四章 西瓜果肉硬度主效基因的定位研究

4．1 材料和方法

4．1．1 材料及群体构建

4．1．5 BSA-Seq数据分析

4．1．6 分子标记的开发

4．1．7 PCR扩增、酶切及电泳

4．1．8 数据统计与分析

4．2 结果与分析

4．2．1 BC7F1世代多态性引物的筛选

4．2．2 BC7F2分离群体的西瓜果肉硬度数据调查分析

4．2．3 SSR标记GNS124与果肉硬度性状的连锁分析

4．2．4 西瓜果肉硬度基因的定位

4．2．5 候选基因预测与分析

4．2．6 与果肉硬度连锁的Caps 3标记在自然群体中的验证

4．3 讨论

4．3．1 西瓜果肉硬度性状的定位研究

4．3．2 木葡聚糖内糖基转移酶在植物发育和果实成熟过程中的作用

4．3．3 乙烯响应元件(ERF)在果实成熟过程中的调控作用

第五章 西瓜果肉可溶性糖和有机酸的比较转录组分析

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．3 西瓜可溶性糖含量测定

5．1．4 西瓜有机酸含量测定

5．1．7 测序数据过滤和比对分析

5．1．8 基因表达定量和差异基因筛选

5．1．9 GO和KEGG通路富集分析

5．1．11 RT-PCR反应

5．1．12 实时荧光定量(qRT-PCR)分析

5．1．13 数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 西瓜果实发育过程中可溶性糖和有机酸含量的动态变化

5．2．2 RNA-Seq数据的综合评价

5．2．3 差异表达基因的鉴定

5．2．4 差异表达基因的GO和KEGG功能富集分析

5．2．5 西瓜果实可溶性糖和有机酸积累与代谢相关基因的表达分析

5．2．6 qRT-PCR验证转录组数据的准确性

5．3 讨论

5．3．1 比较转录组分析试验材料的创新

5．3．2 西瓜果实发育和成熟过程中可溶性糖和有机酸含量的动态变化

5．3．3 可溶性糖合成和代谢相关基因的分析

5．3．4 有机酸积累和代谢相关基因的分析

第六章 西瓜果实酸味性状主效基因的定位研究

6．1 材料与方法

6．1．1 材料及群体构建

6．1．3 西瓜基因组DNA提取

6．1．4 西瓜果实酸味低pH池和高pH池的构建

6．1．6 分子标记的开发

6．1．7 PCR扩增、酶切及电泳

6．1．8 数据统计与分析

6．2 结果与分析

6．2．1 BC7F1世代多态性引物的筛选

6．2．2 BC7F2世代西瓜果实pH调查分析

6．2．3 SSR标记与西瓜果实酸味性状的连锁分析

6．2．4 西瓜果实酸味基因的定位

6．2．5 候选基因预测与分析

6．2．6 与果实酸味连锁的Capsll6标记在自然群体中的验证

6．3 讨论

6．3．1 西瓜果实酸味基因的定位研究

6．3．2 Cla009218和Cla009226在果实发育和成熟过程中的作用

第七章 全文结论

7．1 全文结论

7．1．5 西瓜果肉酸味性状主效基因的精细定位

7．2 全文创新点

7．3 存在问题及展望

参考文献

附录

致谢

作者简历