RNAscope原位杂交技术检测PRRSV方法的建立及初步应用

摘要

RNAscope原位杂交(RNAscope in situ hybridization，简称RNAscope(@))是一种新型原位杂交技术，其原理为碱基互补配对原则，结合信号级联放大技术和背景抑制策略使得该技术在实验室检测中具有一定优势。本实验利用RNAscope(@)成功检测到感染动物组织切片中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，并对其特异性进行检测，结果显示，该技术在PRRSV检测中具有较高特异性。将RNAscope(@)、原位杂交技术(In situhybridization，ISH)和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry，IHC)进行比较时，在连续切片上分别使用三种技术检测PRRSV，定量分析阳性结果表明，RNAscope(@)具有更高的敏感性。图像分析结果显示，在肺脏中，RNAscope(@)与ISH阳性信号的位置与数量基本一致，然而IHC结果显示PRRSV阳性信号明显少于前两者。在胸腺组织中，RNAscope(@)阳性信号在皮质区大量出现;ISH检测中，阳性信号在皮质区局部出现;而IHC结果中，胸腺皮质区PRRSV阳性信号较少。在淋巴结组织中，三种技术检测PRRSV呈现的阳性信号出现的位置一致，但是RNAscope(@)信号数量最多，IHC检测结果次之，ISH阳性信号少于前两者。初步数据统计结果显示，RNAscope(@)的敏感性显著高于ISH和IHC。
　　为扩展RNAscope(@)和IHC技术在兽医学领域的应用范围，本研究以PRRSV感染的组织石蜡切片为样本，建立了RNAscope(@)与IHC双重染色技术。该技术结合RNAscope(@)独特探针与IHC特异性抗原两大优势，实现了在同一切片上核酸与蛋白的双重检测。在肺脏及淋巴结中，利用RNAscope(@)检测PRRSV结合IHC检测巨噬细胞，结果显示RNAscope(@)与IHC均呈现出较好的特异性和敏感性。PRRSV感染宿主后，会引起细胞凋亡，基于此在组织切片上应用RNAscope(@)检测宿主凋亡相关调节基因Bid和Bcl-xl结合IHC检测PRRSV双重染色，结果可以发现PRRSV感染组织中的Bid基因表达水平有上调趋势，Bcl-xl基因表达水平有下调趋势，表明该技术在检测内源性基因过程中也有良好表现。综上，本研究成功建立了RNAscope(@)与IHC双重染色技术。
　　本研究应用RNAscope(@)技术成功检测到组织切片中的PRRSV核酸，同时证明该技术操作简便，并具有高度的特异性、敏感性和重复性。RNAscope(@)与IHC双重染色结果证实该技术不仅在病毒检测中具有高敏感性，在内源基因表达及信号转导等基础研究中也有广泛的应用前景。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)概况

1．1．1 病原学特点

1．1．2 分子生物学特点

1．1．3 流行病学特点

1．1．4 致病性及感染特点

1．1．5 诊断技术

1．1．6 预防及控制

1．2 原位杂交技术的研究概况及发展

1．2．1 经典原位杂交技术

1．2．2 荧光原位杂交技术

1．2．3 RNAscope(R)技术

1．3 本研究的目的及意义

第二章 RNAscope(R)技术检测组织切片中的PRRSV方法的建立

2．1 材料和方法

2．1．1 病毒和细胞

2．1．2 实验动物及组织样本

2．1．3 主要试剂和仪器

2．1．4 PRRSV人工感染动物模型的建立

2．1．5 制备石蜡切片

2．1．6 病理学观察

2．1．7 RT-qPCR检测组织中PRRSV核酸

2．1．8 RNAscope(R)检测组织切片中的PRRSV核酸

2．1．9 数据分析

2．2 结果

2．2．1 成功建立PRRSV高致病毒株HuN4感染动物模型

2．2．2 应用RNAscope(R)技术检测组织切片中的PRRSV核酸

2．3 讨论

第三章 比较RNAscope(R)、ISH与IHC技术的敏感性

3．1 材料和方法

3．1．1 组织样本

3．1．2 主要试剂和仪器

3．1．3 RNAscope(R)技术检测组织切片中的PRRSV核酸

3．1．4 ISH检测PRRSV

3．1．5 IHC检测PRRSV

3．1．6 数据分析

3．2 结果

3．2．1 RNAscope(R)敏感性高于ISH和IHC技术

3．3 讨论

第四章 RNAscope(R)-IHC双重染色的初步应用

4．1 材料和方法

4．1．1 组织样本

4．1．2 主要试剂和仪器

4．2．1 双重染色

4．2．2 数据分析

4．2．3 结果

4．3．1 TUNEL染色

4．3．2 RT-qPCR检测凋亡相关调节基因表达水平变化

4．3．4 数据分析

4．3．5 结果

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历