NGS在AIV检测中的应用及我国2015年-2017年野鸟源H5亚型HPAIVs的生物学特性

摘要

近年来，全球范围内H5亚型高致病性禽流感(HPAI)暴发频率变得更高，NA亚型呈现多样性。我国从家禽和野乌体内亦分离到与多种NA亚型组合的H5亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)，并以clade2344和clade232分支为主。AIV亚型众多，存在不同亚型病毒混合感染现象，给该病的诊断带来了巨大挑战。下一代测序(NGS)经济高效且不依赖于已知序列，在检测AIV时可一次获得病毒8个节段的序列信息，具有传统测序方法所不可比拟的优势。野鸟作为AIV的天然储存宿主，在其进化和跨物种传播中发挥着重要作用，增大了AIV通过基因重配产生新病毒的概率。
　　为寻找更为高效的AIV检测方法，探索NGS在AIV检测中的具体应用，并了解我国近年野鸟源H5亚型HPAIVs的生物学特性，本研究利用AIV全基因组通用扩增引物对两份AIV样品进行全基因组序列扩增，用以制备NGS模板，并进行illumina高通量测序和测序深度、AIV亚型预测等生物信息学分析。同时，对我国2015年-2017年野鸟源H5亚型HPAIVs进行全基因组序列测定，对表面基因HA裂解位点、潜在糖基化位点、受体结合位点，NA颈部缺失，内部基因中增强病毒对小鼠致病性的相关氨基酸位点及各基因同源性、遗传进化、基因型等进行系统分析，并选取代表毒株进行BALB/c小鼠致病性试验，评估其对哺乳动物的致病性。
　　结果，成功利用一步扩增法制备出AIV高通量测序模板，M和NS基因测序深度最大，样品1为H5N2和H9N2亚型AIV混合感染，其中，H9N2为优势毒株。样品2为一株H5N8亚型AIV，且全基因组序列获取完全。
　　本研究中所有HPAIVs的HA蛋白裂解位点为-R/KRRKR*G-，呈典型HPAIV分子特征，均具有26(NNS)、27(NST)、39(NVT)、181(NNT)、302(NSS)、499(NGT)、558(NGS)等高度保守的糖基化位点，且clade2321c分支HPAIVs具有156(NSS)糖基化位点，clade2321d分支HPAIVs具有170(NDT)糖基化位点，clade2344分支SW/HuN/4/2016(H5N6)、WG/HuN/1/2017(H5N6)具有135(NSS)糖基化位点，所有病毒在226-228位(H3number)只具备禽型受体结合位点，N1蛋白和N6蛋白发生颈部缺失，N2和N8蛋白无颈部缺失，全部HPAIVs的M1(30D、215A)，和NS1(42S)，GBH Gull/QH/9/2015(H5N1)和PS/HuN/2/2016(H5N6)的PB2(627K)均呈现对小鼠毒力增强突变，HA、NA及M基因各自的氨基酸和核苷酸同源率范围相近，其余5个内部基因相差较大，HA基因分别属于clade2321c、clade2321d和clade2344分支，来自clade2321c、clade2321d分支的N1基因进化为两个分支，N2、N6、N8基因属于欧亚分支，内部基因分别进化为多个分支，并且绝大部分病毒来源于同亚型病毒，部分病毒为多亚型重组病毒，25株HPAIVs共划分为10个基因型，表明我国2015年-2017年野鸟源H5亚型HPAIVs具有遗传多样性。
　　BALB/c小鼠致病性试验数据表明，代表毒株未经适应均获得了对哺乳动物的感染能力，能在小鼠呼吸系统中进行有效复制，但对小鼠的致病性存在差异。
　　本研究表明应用NGS检测AIV混合样品时，在文库的构建和拼接软件的选择方面要求更高，为实验室应用NGS检测AIV提供了参考;同时，应加强对野鸟AIV的全面及主动监测，为H5亚型高致病性禽流感综合防控政策的制定奠定基础。

目录

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摘要

第一章 引言

1．2．3 分子生物学检测

1．2．4 高通量测序技术

1．3．1 HA蛋白

1．3．3 PB2蛋白

1．3．7 M1蛋白

1．4．2 我国禽流感流行动态

1．4．3 野鸟在全球禽流感流行中的角色

1．5 本实验研究目的及意义

2．1 材料

2．2．3 反转录合成cDNA

2．2．6 Illumina高通量测序及生物信息学分析

2．3 结果

2．3．1 PCR产物的鉴定

2．3．2 测序质量控制分析

2．3．3 参考序列比对与质量分析

2．4 讨论

第三章 野鸟源H5亚型HPAIVs的遗传演化分析

3．1 试验材料

3．1．2 主要试剂及仪器

3．1．3 实验动物

3．2．3 PCR产物的鉴定与纯化

3．2．6 各节段序列的拼接和进化树构建

3．3 试验结果

3．3．1 HA节段特征及遗传演化分析

3．3．2 NA节段特征及遗传演化分析

3．3．3 内部基因节段特征及遗传演化分析

3．3．4 基因型的划分

3．4 讨论

第四章 野鸟源H5亚型HPAIVs对BALB/c小鼠的致病性研究

4．1 试验材料

4．2．3 BALB/c小鼠的感染与致病性试验

4．3 结果

4．3．1 病毒MLD50的测定

4．3．2 小鼠各脏器中病毒复制情况

4．3．3 不同AIVs感染后小鼠体重变化情况

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

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