水稻叶形基因NL7的克隆及其分子调控机理研究

摘要

水稻(Oryza sativa L.)叶片形态是植株形态建成的重要部分，是育种家选育具理想株型超高产水稻新品种(组合)的重要性状。通过图位克隆分离叶形调控基因，不仅有助于解析水稻叶形发育遗传调控网络，而且有助于水稻株型的改良和理想株型分子设计育种。本研究利用甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate，EMS)诱变水稻籼稻品种蜀恢527(SH527)获得一份能够稳定遗传的窄叶突变体(narrow leaf7,nl7)。 形态观察表明，nl7上三叶的叶长无显著差异，但叶宽极显著变窄;与野生型相比，虽然nl7有效分蘖数显著增加，但单株产量显著降低;nl7各节茎秆长度和宽度均呈不同程度降低;穗部性状除籽粒宽度没有显著差异外，nl7的其余性状(包括穗粒数、结实率、千粒重、籽粒的长度和厚度)都呈显著或极显著下降。叶片组织细胞学观察和颖壳电镜扫描结果发现，相较野生型，nl7叶片的泡状细胞、叶肉细胞和维管束大小没有明显差异，但大、小维管束数目则极显著减少;颖壳细胞长度和宽度没明显差异，推测是细胞数目引起籽粒形态的变化。生理实验表明，在分蘖期，nl7的叶绿素含量和SPAD值没有显著变化;nl7的气孔导度和蒸腾速率均极显著降低，但是胞间CO2浓度显著高于野生型。 遗传分析结果表明，nl7的窄叶性状由一对隐性核基因控制。利用图位克隆技术将NL7基因定位在标记C7-8和C7-9之间，物理距离约36.405Kb，存在5个开放阅读框。根据测序结果发现，只有在LOC_Os07g09450基因ATG下游127bp位置发生单碱基替换(T/G)，预测该基因编码一个热激蛋白(DnaJ)，是一个未被克隆的新基因。因此，我们初步推测LOC_Os07g09450为候选基因NL7。Real-time PCR结果表明，NL7在SH527的各个组织器官中组成型表达，在幼叶中的表达水平最高;利用GFP作为标签，确定NL7蛋白定位于细胞质。进化分析显示，NL7蛋白在不同物种间的序列高度保守。基因敲除分析表明，LOC_Os07g09450基因功能的缺失，导致叶片宽度减小。内源激素测定结果表明，n;7的独脚金内酯(Strigolactones，SL)含量和反式玉米素核苷(Trans-Zeatin-Riboside，TZR)含量分别极显著和显著性降低。通过分析分蘖期各基因转录水平，发现NL7可能与纤维素合酶、独脚金内酯、赤霉素和生长素生物合成有关。酵母文库筛选结果表明，有7个基因可能与NL7存在互作关系，进一步通过酵母双杂验证，发现NL7蛋白与LOC_Os01g03820和LOC_Os01g31690存在互作关系。