百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)对水稻拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)的作用机理研究

摘要

拟禾本科根结线虫（Meloidogyne graminicola）是水稻种植系统中危害最为严重的病原线虫之一。目前广泛应用的化学杀线虫剂对环境危害较大且使用成本较高，亟待筛选出对环境有益且易于推广的绿色防控技术来替代化学杀线虫剂。本研究以拟禾本科根结线虫为研究对象，通过形态学和分子生物学手段鉴定了一株生防真菌AW2017，通过优化杀线虫代谢产物的发酵工艺，探究了最适宜的发酵培养条件;通过室内生测和盆栽试验、巨细胞组织切片及水稻防御相关基因的表达分析，进一步明确百岁兰曲霉对拟禾本科根结线虫的作用机制，以期为开发防控拟禾本科根结线虫的生防菌剂、发展绿色防控技术提供理论依据。主要研究结果如下: 经形态学特征和分子生物学分析，AW2017菌株与曲霉属形态非常相似、且Cam与BenA基因与百岁兰曲霉的同源性分别高达75％和89％，从而将AW2017鉴定为百岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)。 通过室内生物测定，评价了百岁兰曲霉孢子悬浮液对水稻根结线虫幼虫和卵的毒力，发现5×AW2017处理72h后，根结线虫幼虫死亡率高达86.2％;处理8天后，根结线虫卵孵化抑制率达47.3％，表明百岁兰曲霉孢子悬浮液对水稻根结线虫幼虫有良好的毒杀作用，对于卵孵化也有较好的抑制作用。 通过室内接种实验，测定了百岁兰曲霉孢子悬浮液对根结线虫行为的影响。诱集实验表明，与PDB对照相比，在距离接种中心1.5-3.0cm和3.0-4.5cm的区域，5×AW2017处理分别可降低线虫的迁移率37.3％和39.6％，侵入根部的线虫减退率高达64.9％。温室盆栽实验表明，施用5×AW2017孢子悬浮液后，根结数量可降低24.5％，根内侵入的线虫数量减少40.5％，且侵入的线虫发育进程明显延缓。显微切片结果表明，AW2017处理后的巨细胞比对照表面积减小了77.6％，发育明显延迟。说明AW2017减少水稻根系对拟禾本科根结线虫的诱集作用，减少根内线虫的侵入数量并抑制其发育。 在原有摇瓶发酵的基础上，对百岁兰曲霉在500L发酵罐中产生杀线虫活性代谢物的发酵工艺进行了优化。确定了接种体积为8％、通气量为4m3/h、溶氧水平为25％的菌种最佳发酵培养条件，同时明确了菌种最佳发酵培养时间为120h。在该条件下，以PDB为对照，AW2017的线虫校正死亡率高达91.3％，说明该发酵体系可用于AW2017杀线虫活性物质的量化生产。 通过qRT-PCR分析，初步研究了AW2017对水稻防御相关基因表达的影响。分别在接种6h和72h后，AW2017发酵液处理的水稻根系内ET合成相关基因OsACO7和OsACS1的相对表达量明显上调;但测试时间内ET响应基因OsERF1、OsERF70、OsEBP89以及调控基因OsEIN2的相对表达量变化不显著。此外，AW2017处理后，水稻根内其他信号途径的相关基因表达量无显著变化。说明AW2017可能通过诱导ET合成途径相关基因表达量上调来防御根结线虫的侵入。 综上所述，百岁兰曲霉代谢产物可抑制根结线虫的侵入和发育，激活水稻防御相关基因的表达，能有效控制拟禾本科根结线虫的危害，具有良好的开发应用潜力。本研究为开发水稻根结线虫生防菌剂、发展线虫绿色防控技术提供了新思路。