表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热病毒Snyder Hill株的研究

摘要

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的一种致死性人畜共患传染病，能引起人和哺乳动物的急性、渐进性致死性脑膜脑炎。全球每年约有59，000人以及数十万的动物死于狂犬病，其中95％以上的死亡病例发生在亚洲和非洲，99％以上的人狂犬病死亡病例是由感染RV的犬舔舐或咬伤引起。减少和控制人感染狂犬病病例数最有效的方法是提高犬的免疫覆盖率，当犬的免疫覆盖率达到70％便可从源头上控制、消除狂犬病。目前，狂犬病弱毒活疫苗已禁止生产和使用;灭活疫苗虽安全有效，但成本高昂。因此，研制一种高效、安全、价格低廉的动物狂犬病疫苗仍具有较高的应用价值和现实意义。
　　犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一种在犬科、鼬科、浣熊科以及其它肉食动物之间广泛传播的一种病毒性传染病。该病呈季节性流行，且宿主范围不断扩大，呈世界性分布，严重威胁畜牧养殖业的健康发展。CD弱毒疫苗能有效预防和控制该病在肉食动物之间的传播，应用广泛。反向遗传技术的发展和成熟使CDV作为疫苗载体成为可能。CDV也具备作为疫苗载体应用的潜力，以CDV为载体构建CDV/RV二联活载体疫苗可实现一苗两防、经济高效的提高狂犬病免疫覆盖率。
　　本研究以本实验室分离的CDV Snyder Hill疫苗株为亲本毒株，建立其反向遗传操作系统，拯救成功的病毒rCDV和野生型CDV Snyder Hill在Vero细胞上保持相似的生长特性，在感染后120h病毒滴度达到最高1×106.1TCID50/mL。为探索CDV Snyder Hill株作为活病毒载体表达外源基因的潜力，在CDV基因组P、M之间插入外源基因EGFP构建重组病毒rCDV-EGFP，经生长曲线和遗传稳定性检测，重组病毒与亲本株rCDV的生长特性相似，且重组病毒在Vero细胞上连续传18代仍能高效、稳定表达EGFP，具有良好的遗传稳定性。在此基础之上，构建了重组病毒rCDV-RVG，经IFA、Western Bloting鉴定分析，RVG蛋白在重组病毒感染的细胞中正确、稳定表达，拯救的重组病毒与亲本株病毒在Vero细胞上具有相似的生长动力学曲线，病毒滴度最高可达1×105.7TCID50/mL。犬免疫实验证明，重组病毒rCDV-RVG以105.5TCID50/mL/只剂量免疫犬3w后，犬体内均可产生特异性CDV、RV中和抗体，其中RV中和抗体平均值为21.71IU/mL，远高于RV中和抗体保护临界值0.5IU/mL。
　　本研究结果表明，表达RVG蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-RVG具备作为狂犬病重组活载体疫苗的潜力。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1．1 狂犬病病毒分子特征

1．1．2 狂犬病的流行与传播

1．1．3 犬用狂犬病疫苗现状

1．2 犬瘟热概况

1．2．1 犬瘟热病毒分子生物学特征

1．2．2 犬瘟热疫苗现状

1．2．3 犬瘟热病毒反向遗传技术的发展

1．3 本研究的目的与意义

第二章 犬瘟热病毒Snyder Hill株反向遗传操作系统的建立

2．1 材料

2．1．1 病毒株、细胞和质粒

2．1．2 主要试剂与仪器

2．1．3 引物设计与合成

2．2 方法

2．2．1 CDV Snyder Hill株病毒基因组的提取、反转录和PCR

2．2．2 CDV Snyder Hill株全基因组测序

2．2．3 CDV Snyder Hill株基因序列拼接与H基因序列分析

2．2．4 CDV Snyder Hill株病毒基因组全长cDNA克隆的构建

2．2．5 CDV Snyder Hill株辅助质粒的构建

2．2．6 CDV Snyder Hill株病毒拯救

2．2．7 拯救病毒的鉴定

2．2．8 种毒制备与病毒滴定

2．2．9 病毒生长动力学曲线的测定

2．3 结果

2．3．1 CDV Snyder Hill疫苗株H基因同源性分析

2．3．2 CDV Snyder Hill株基因组全长cDNA克隆及其辅助质粒构建

2．3．3 CDV Snyder Hill株病毒拯救与鉴定

2．3．4 rCDV病毒生长曲线的测定

2．4 讨论

第三章 表达绿色荧光蛋白(EGFP)重组犬瘟热病毒Snyder Hill疫苗株的构建及其生物学特性研究

3．1 材料

3．1．1 病毒、细胞和质粒

3．1．2 主要试剂及仪器

3．1．3 引物的设计与合成

3．2 方法

3．2．1 表达EGFP的重组CDV Snyder Hill株病毒基因组cDNA克隆的构建

3．2．2 表达EGFP外源基因的重组病毒的拯救

3．2．5 rCDV-EGFP病毒遗传稳定性的检测

3．3 结果

3．3．1 表达EGFP重组CDV Snyder Hill株病毒基因组全长cDNA克隆构建

3．3．2 表达EGFP外源基因的重组犬瘟热病毒的拯救

3．3．3 重组病毒rCDV-EGFP的鉴定

3．3．4 重组病毒rCDV-EGFP体外生长特性

3．3．5 rCDV-EGFP遗传稳定性检测

3．4 讨论

第四章 表达狂煸病毒G蛋白(RVG)重组犬瘟热病毒Snyder Hill疫苗株的构建及其生物学特性与免疫原性研究

4．1 材料

4．1．1 病毒、细胞、质粒和实验动物

4．1．2 主要试剂及仪器

4．1．3 引物的设计与合成

4．2 方法

4．2．1 表达RVG的重组CDV Snyder Hill株病毒基因组cDNA克隆的构建

4．2．2 表达RVG的重组病毒的拯救

4．2．5 重组病毒rCDV-RVG免疫比格犬

4．2．6 中和试验

4．3 结果

4．3．2 重组病毒rCDV-RVG的鉴定结果

4．3．3 重组病毒rCDV-RVG体外生长特性

4．3．4 重组病毒rCDV-RVG对犬的免疫效力

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历