基于微滴式数字PCR的有机磷农药多残留生物条形码免疫分析方法研究

摘要

农产品质量安全问题关乎国民健康和社会稳定。不合理的使用农药对环境甚至是人类健康造成很大威胁，为了满足农药残留标准的要求，需要建立一种高灵敏度、高准确性的检测方法。生物条形码免疫分析方法依据抗体识别抗原，基于胶体金和核苷酸链信号放大技术、磁性纳米粒子分离技术的特性来实现对农药的检测。微滴式数字PCR(ddPCR)作为一种绝对定量检测技术被广泛应用于医学、转基因检测、微生物检测等领域，还没有关于ddPCR检测农药的报道，本研究将免疫竞争反应解离下来的生物条形码DNA链在ddPCR上进行定量检测。主要研究内容与结果为: 制备胶体金纳米探针和磁性纳米探针，设计了一组特异性很高的PCR扩增所需的DNA模板、上下游引物和探针，并优化了PCR扩增时的退火温度，上下游引物浓度和探针浓度。对胶体金纳米探针和磁性纳米探针的工作浓度、甲醇含量进行了优化。在最优条件下建立标曲，其三唑磷的检出限(IC10)分别为0.002ng mL-1，IC50的值为0.197ng mL-1。线性检测范围为0.01-20ng mL-1。对苹果、黄瓜、卷心菜和大米四种基质进行了添加回收实验。该方法的平均回收率在76.9-94.4％之间，相对标准偏差(RSD)在10.8-19.9％之间。该方法在苹果、黄瓜、卷心菜和大米四种样品基质中的回收浓度与LC-MS/MS在四种样品基质的回收浓度做相关性实验，发现线性良好，也证明了基于ddPCR的生物条形码免疫分析方法的可靠性，可以用于农产品中三唑磷农药残留的限量检测。 建立了基于ddPCR的生物条形码免疫分析方法同时检测三唑磷，对硫磷和毒死蜱三种农药，本章设计了另外两组DNA链、上下游引物和探针。优化了这两组序列PCR扩增的退火温度、上下游引物和探针浓度。优化了需要加入对硫磷和毒死蜱抗体的含量和DNA的含量。做了关于三种抗体之间特异性的实验，发现特异性较好。对抗原和抗体的工作浓度进行了优化。在最优条件下建立标曲，其三唑磷、对硫磷和毒死蜱的检出限(IC10)分别为0.22ng mL-1，0.45ng mL-1和4.49ng mL-1。对苹果、黄瓜、卷心菜和梨基质进行了添加回收实验。该方法的平均回收率在75.5-98.9％之间，RSD在8.3-16.7％之间。该方法在梨中的回收浓度与LC-MS/MS在梨基质的回收浓度做相关性实验，发现线性良好，证明了基于ddPCR的生物条形码免疫分析方法的准确可靠性。本研究建立的基于微滴式数字PCR的生物条形码免疫分析方法能够同时检测三唑磷、对硫磷和毒死蜱。也为实现高通量的检测更多种农药奠定了基础。