禽腺病毒血清4型重组株的构建及生物学特性研究

摘要

肝炎-心包积水综合征（Hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS）是由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus4，FAdV-4)引起的以肝炎、心包积水为特征的疾病。自2015年以来，HHS在中国大面积流行，给中国养禽业造成了严重的经济损失。然而关于FAdV-4的毒力基因则研究较少。 为探讨ORF17基因对FAdV-4复制和毒力的影响，本研究以FAdV-4流行毒株HN/15102株为亲本病毒，采用同源重组技术构建ORF17基因缺失的重组病毒。首先将表达EGFP的pΔORF17-EGFP转染已感染HN/151025的鸡肝癌细胞(LMH)，构建重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP。再将EGFP表达盒去除，经蚀斑反向筛选获得rHN-ΔORF17。将rHN-ΔORF17在LMH细胞上连续传代20代，每5代进行PCR检测，结果表明rHN-ΔORF17遗传稳定。生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致，均在接种后96h病毒滴度达到高峰。rHN-ΔORF17与亲本病毒HN/151025病毒滴度相近，分别为2.22×108PFU/mL和4.26×108PFU/mL，表明ORF17基因缺失不影响病毒复制能力;而rHN-ΔORF17-EGFP滴度显著下降(1.53×106PFU/mL)与亲本病毒HN/151025差异显著(P＜0.05)。 中国分离株FAdV-4与加拿大ON1弱毒株相比，基因组3'端缺失1966-bp序列（ORF19和ORF27），为了解该自然缺失对病毒毒力的影响，本研究以基因组3'端35430-35431位点自然缺失1966-bp序列的HN/151025为亲本病毒，构建表达EGFP的重组病毒rHN-Δ35430-EGFP。然后将1966-bp序列替换EGFP表达盒，构建补足ON1株来源的1966-bp序列的重组病毒rHN-Δ35430-ON1。rHN-Δ35430-ON1在LMH细胞上连续传代20代，每5代进行PCR检测，结果表明rHN-Δ35430-ON1遗传稳定。重组病毒生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的复制动力学趋势基本一致，均在接种后96h病毒滴度达到高峰。rHN-Δ35430-EGFP滴度为6.8×107PFU/mL，rHN-Δ35430-ON1滴度(2.66×108PFU/mL)与亲本病毒HN/151025(4.26×108PFU/mL)相近，说明插入1966-bp序列不影响病毒复制。 对rHN-ΔORF17和rHN-Δ35430-ON1进行致病性评价。将40只28日龄SPF鸡随机分成4组，其中3组分别用rHN-ΔORF17、rHN-Δ35430-ON1和HN/151025通过滴鼻点眼途径进行攻毒，攻毒剂量为0.1mL8×105PFU，对照组为等体积无菌PBS，攻毒后观察鸡只症状。攻毒后第3d，rHN-ΔORF17和HN/151025组鸡只开始出现临床症状，rHN-Δ35430-ON1组鸡只于攻毒后第4d出现临床症状，发病鸡只表现为精神沉郁、缩脖、羽毛蓬乱、喜卧嗜睡等;攻毒组发病率均为100％，发病高峰期均在攻毒后第4～6d，攻毒后第14d各组鸡只逐渐开始康复。攻毒组中，HN/151025组死亡率为10％，rHN-ΔORF17组死亡率为20％，rHN-Δ35430-ON1组死亡率为10％，对照组为0。对死亡鸡只进行病理剖检，攻毒组均表现心包积液、肝脏黄色坏死灶、肾肿大，无明显差异。免疫组化攻毒组肝脏均检测到抗原。攻毒后第4～28d，每4d采集咽肛拭子和血清抗体。咽肛拭子排毒检测中，3组攻毒组鸡只均在第4～20d检测到100％排毒，第24d排毒下降，3组表现一致。血清抗体检测中，整体抗体水平无差异，仅在抗体阳转率存在差异。HN/151025组阳转率最高达88.9％，rHN-ΔORF17组阳转率最高为50％，rHN-Δ35430-ON1阳转率最高为33.3％。在第32d进行第2次攻毒，3组均无明显临床症状。抗体阳转率也无明显差异。咽肛拭子排毒，第4～27d排毒率100％，第34～55d下降后上升，在第62d排毒率达100％，3组表现一致，无明显差异，且均排毒反复，排毒期长。上述结果表明，2株重组病毒对鸡的致病性与亲本病毒差异不显著。 综上，ORF17基因缺失和插入自然缺失1966-bp序列对病毒复制和致病性均无影响。