丝状真菌天冬氨酸蛋白酶的自激活机制与热稳定性改良研究

摘要

天冬氨酸蛋白酶又称酸性蛋白酶，在食品、发酵、饲料、医药和皮革等行业广泛应用。但这类蛋白酶的热稳定性通常较差，限制了它的应用。因此，发掘高温天冬氨酸蛋白酶资源或通过分子改良提高其热稳定性，对研究天冬氨酸蛋白酶的稳定性机制、拓宽其应用范围具有重要意义。 本文从具有不同特性（嗜酸、耐热、低温等）的丝状真菌Talaromyces leycettanus JCM12802、Thermoascus crustaceus JCM12803、Bispora sp.MEY-1和Penicillium sp.JJ-1中克隆了6个天冬氨酸蛋白酶基因(Tlap、Tlapa1、Tcapa、Bsapa、Psapa和Psapb)并成功地在毕赤酵母中进行了表达。6个重组蛋白酶(TlAP、TlAPA1、Tc APA、BsAPA、PsAPA和PsAPB)的最适pH多在3.0-3.5之间，在pH2.0-4.0的条件下具有高催化活力，它们能够在酸性条件下保持稳定，其中来源于嗜酸菌Bisporasp.MEY-1的BsAPA在酸性条件的稳定性最好。这6个天冬氨酸蛋白酶活性和稳定性受温度的影响差异很大，来源于Penicillium sp.JJ-1的PsAPA的最适温度最低为50℃，BsAPA的最适温度高达75℃。且BsAPA热稳定性明显高于其它5个蛋白酶和商业用酸性蛋白酶，在70℃条件下处理1h后仍有80％以上的剩余酶活。因此，BsAPA是研究天冬氨酸蛋白酶热稳定性的理想材料。在最适条件下，BsAPA以酪蛋白为底物时的比活力高达6537±109U/mg，高于其它同类型酸性蛋白酶;它还能有效分解一些难降解的天然底物，如麦醇溶蛋白(627±73U/mg)和谷蛋白(449±57U/mg)。以上性质表明BsAPA具有广泛的应用前景。 天冬氨酸蛋白酶以酶原的形式表达并分泌到胞外，然后在酸性条件下完成前肽切割产生成熟酶分子。我们研究发现T.leycettanus JCM12802来源的TlAPA1的激活过程不同于以往的报道的一步激活，而是分成两个阶段:首先是由缓冲液的pH介导地激活，形成中间体，然后是依赖于蛋白酶水解活性的中间体进一步切割产生成熟酶。对TlAPA1激活过程的研究不仅确定了天冬氨酸蛋白酶的最适激活条件，而且加深了我们对该类蛋白酶自激活机制的认识。 我们对冬氨酸蛋白酶BsAPA进行了晶体结构解析。通过结构分析发现Y282位点可能与天冬氨酸蛋白酶BsAPA的热稳定性密切相关。我们对Y282进行了饱和突变研究，分析各突变体的热稳定性和催化活性时发现，突变体Y282L较野生型在75℃条件下稳定性明显提高，处理5min后剩余酶活力由47.2％提高到了75.3％;突变体Y282H提高了蛋白酶的比活力(7296±114U/mg vs6537±109U/mg)。目前，BsAPA的突变体已应用于工业生产。 研究还发现天冬氨酸蛋白酶的高温失活可能与其在高温条件下的自切割有关。因此，我们通过分析BsAPA高温下自切割后肽段碎片N端序列确定了BsAPA的切割位点(L205-F206)。通过分析该切割位点的序列特征和结构特点，对该位点周边氨基酸残基进行突变研究。突变体F193W、K203E、K204P和A371V在75℃处理5min的剩余酶活分别为72.4％、65.3％、67.4％和68.2％，较野生型BsAPA(47.2％)均有不同程度提高。蛋白酶的自切割与热稳定性研究为我们进行热稳定性改良提供了新的思路。 本论文通过资源挖掘获得了6个天冬氨酸蛋白酶基因并实现了在毕赤酵母中的表达。研究酶原蛋白的体外激活过程，分析比较6个天冬氨酸蛋白酶的性质，最终获得了一个高温高活力对天然底物具有高效水解能力的天冬氨酸蛋白酶BsAPA。通过对BsAPA的晶体结构的解析和突变研究，提高了其催化活性和热稳定性。同时，还发现了天冬氨酸蛋白酶热稳定性与自我切割之间的关系并通过相关突变提高了BsAPA的自切割抗性。以上研究为天冬氨酸蛋白酶的热稳定分子改良提供了重要的参考，也拓宽了该酶在高温下的应用范围。