弓形虫感染早期家猫小肠转录组学和蛋白组学研究

摘要

弓形虫是一种专性寄生于真核细胞内的原虫。因弓形虫感染而引起的弓形虫病是一种重要的人兽共患病，广泛流行于猪、羊、马、狗、鸡、猫以及人类等几乎所有温血动物。猫及猫科动物是弓形虫业已发现的唯一终末宿主，其小肠组织是弓形虫有性生殖的唯一场所。研究表明，弓形虫感染猫8h后，便会在小肠上皮细胞转向配子发育，配子体和卵囊的形成持续4-6d。人类误食含有弓形虫卵囊的食物或水是获得弓形虫病的主要途径之一，可导致婴儿、孕妇以及免疫功能低下者严重的临床症状甚至死亡。但是，目前人们对弓形虫在猫小肠组织内的裂殖生殖及配子发育过程知之甚少，对弓形虫在猫小肠组织发育成卵囊的分子机制尚不清楚。这严重制约着猫用弓形虫新型疫苗与高效药物的创制。本研究以弓形虫感染早期猫的小肠组织为研究对象，对感染后不同时间段猫小肠组织的转录组和蛋白组进行了研究，实验结果可为揭示弓形虫早期配子发育的分子机制奠定基础。 用弓形虫PRU株的包囊经口感染狸花猫，分别收取感染后第6h、12h、18h、24h、72h、96h及未感染的猫小肠组织，通过RNA-seq高通量测序和iTRAQ定量技术，对弓形虫感染早期猫小肠的转录组和蛋白组进行测序与分析。 1.弓形虫感染早期猫小肠转录组学的研究 共鉴定出2363个差异表达基因，与对照相比，感染6h、12h、18h、24h、72h和96h时的差异表达基因个数分别为:56个、184个、404个、508个、400个和811个。上调表达的差异基因主要集中在D2、D3和E2染色体，下调表达基因主要集中在X染色体。GO分析显示，在弓形虫感染早期过程中，催化活性和代谢过程是富集最多的两个生物学过程。KEGG信号通路分析表明，弓形虫感染猫的各时间点均富集有大量的差异信号通路，在感染后96h富集的通路最多。弓形虫的感染还调控了MHCⅠ递呈、HSP结合和蛋白酶体应答反应等特殊信号通路的变化。另外，在差异表达基因中还富集了参与异生物质代谢和阿尔兹海默症过程的基因。 2.弓形虫感染早期猫小肠蛋白组学的研究 共得到3401个可信蛋白，其中差异蛋白的总数为649个，与对照相比，感染6h、12h、18h、24h、72h和96h时的差异蛋白个数分别为:76个、102个、85个、177个、262个和320个。差异蛋白的KEGG分析表明，弓形虫感染猫的各时间点均富集有三大营养物质（糖类、脂肪和氨基酸）的代谢通路，提示在弓形虫感染猫早期，需要积累大量的营养物质及代谢产物。利用String数据库，对差异蛋白的相互作用进行了预测。利用平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)方法验证了蛋白组测序的质量。PRM鉴定的6个蛋白与蛋白组测序结果一致，说明蛋白组测序结果可信度高。将转录组与蛋白组的测序结果进行关联分析，共得到184个差异表达基因。 3.弓形虫感染猫早期表达蛋白的反应原性研究 基于弓形虫早期感染猫小肠蛋白组数据，选取了7个弓形虫蛋白进行了表达水平的qRT-PCR验证，其中6个基因的转录水平较对照组显著上升;在qRT-PCR验证的基础上，经生物信息学分析，选取了其中的5个蛋白进行了基因的克隆和原核表达。利用猫弓形虫的阳性血清对5个重组蛋白进行了反应原性的分析，rTgPr4蛋白反应原性最强，rTgPr6蛋白不具有反应原性。本试验最后研究了以rTgPr4蛋白为诊断抗原，建立猫弓形虫病ELISA诊断方法的可行性。结果表明，该蛋白可以作为诊断抗原建立猫弓形虫病的ELISA诊断方法。