烟草打顶诱导的腋芽转录组分析及相关基因功能研究

摘要

顶端优势是植物中存在的一种用于调控顶芽优先生长而对侧枝的生长产生抑制的现象，当顶芽缺失后，顶端优势丧失，侧枝会迅速生长。在烟草的生产过程中，烟株打顶是提高烟叶质量和产量的一项重要的农艺学措施。但打顶后侧技会变得异常活跃。为了进一步了解打顶后侧枝迅速生长的分子机理，本研究分别利用转录组测序技术、腋芽调控基因定向突变、基因编辑、候选目的基因RACE克隆、腋芽突变体筛选鉴定等技术或策略对烟草腋芽生长相关基因展开研究。具体结果如下 1.烟草初花期植株打顶后，分别对未打顶烟株和打顶后1、3、5天烟株相同叶位腋芽进行单株取样，设置3次生物学重复，进行转录组测序，每个样本都获得超过7GB的clean reads。GO富集分析发现细胞内碳水化合物代谢过程与二糖的代谢过程中DEGs可能与腋芽中淀粉的积累和腋芽的胁迫/防御反应有关。KEGG分析显示许多差异基因参与淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢以及植物激素信号转导等过程，这些过程均有可能参与打顶过后腋芽的生长。对转录组数据进行转录因子预测，结果发现GRAS家族、MYB家族、LOB家族等参与植物分枝发育的转录因子家族数量较多。其中GRAS家族的LS基因，MYB家族的RAX和MYB44基因以及LOB家族的LOB11基因等在打顶前后基因表达水平差异显著。对打顶前后根组织转录组的分析发现，独脚金内脂合成途径上的MAX3和MAX4基因表达水平差异显著。 2.利用基因编辑技术对转录因子MYB44和LOB11进行基因编辑，每个目标基因分别选择3个基因编辑靶位点，受体品种为K326。在T0代转基因植株中，MYB44基因在2号靶点检出基因编辑阳性株，阳性率24％;LOB11基因在3号靶点检出基因编辑阳性株，阳性率40％。对T1代基因编辑纯合体筛选鉴定的工作还在进行中。 3.分别在打顶后1天、3天、5天对K326烟株腋芽部位喷施人工合成独角金内酯类似物GR24,共喷施3次，施用浓度:10-9M，10-8M，10-7M，10-6M，以去离子水为对照。结果表明GR24具有抑制腋芽生长的作用，对打顶后烟株腋芽部位喷施GR24能够降低打顶后烟株分枝的长度、鲜重和茎围，差异显著。 4.通过RACE克隆获得烟草独角金内酯合成相关基因NtMAX3和NtMAX4,NtMAX3全长2253bp，ORF1188bp，翻译395aa;NtMAX4全长2135bp，ORF1671bp，翻译556aa。针对这两个基因，分别构建了其RNAi和过表达载体，并转化烟草，结果发现RNA干扰NtMAX3和NtMAX4后的转化植株表现多腋芽（分枝）,株高矮化，且与野生型差异显著。NtMAX3和NtMAX4过表达转化植株与野生型无显著差异。 5.对1011个EMS诱变“中烟100”M2代突变群体进行性状调查并筛选腋芽（分枝）突变体，发现突变株系586个，株系突变率为57.96％，突变单株2876株，单株突变率为19.88％。连续筛选至M5代，共获得15个多腋芽（分枝）突变体，其中8个突变体遗传稳定。突变体mbd3多分枝突变表型与野生型相比差异显著，对野生型与mbd3杂交杂合F1代（中烟100×mbd3）、F2代（中烟100×mbd3）和BC1F1代（F1×mbd3）现蕾期后调查记录各世代腋芽（分技）性状表型，遗传分析结果显示，F2代群体中野生型与突变型的分离比符合理论分离比3∶1，BC1F1代群体中野生型与突变型的分离比，符合理论分离比1∶1,表明mbd3突变性状遗传受一对隐性核基因控制。