利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株及其检测方法的建立

摘要

鸡马立克氏病(Marek's disease，MD)是一种由鸡马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的、鸡的淋巴组织增生性传染病，该病给养禽业造成巨大的经济损失。MD疫苗的使用很好地控制了该病，但其病原MDV呈现持续进化的趋势，给该病的防控带来困难。基因缺失疫苗由于删除了致病基因、同时最大程度保留了免疫原性，是最有发展前景的MD疫苗，这种疫苗具有良好的安全性和更高的免疫效力。由于MD疫苗不能建立免疫屏障，不能阻止野毒感染，为MDV的检测和监控带来困难。对MDV流行毒株的流行病学、病原学研究和新疫苗的开发是控制该病的主要措施。发展更好的病毒基因编辑技术和检测、监测方法是非常有必要的。 本实验室分离的一株MDV野毒株BS/15株，基因分析表明其具有中国流行毒株的特有突变，同时其在体内复制能力强，具有更强的溶细胞感染能力和表现“晚毒力”特征。以其为亲本病毒构建基因缺失疫苗，具有成为高效MD疫苗的潜力。本研究利用CRISPR/Cas9技术，以BS/15株为研究模型，对其基因组中的主要致瘤基因meq基因进行了缺失。试验中，依据中国MDV分离株BS/15株的meq基因序列，设计了8条靶向meq基因的小向导RNA(sgRNA)，分别克隆到pX330质粒中，构建了表达靶向meq基因sgRNA的质粒pMeq-sgRNA。通过pMeq-sgRNA转染、测序分析方法初步评价sgRNA切割效果，选择了两条适合的sgRNA。在鸡胚成纤维细胞(CEF)上同时转染上述筛选的2个pMeq-sgRNA质粒，接种MDV分离株BS/15株，通过PCR检测筛选meq基因缺失克隆株，成功克隆到一株meq基因缺失毒株rBS△Meq株。序列分析证明获得的MDV重组毒株已按预期的切割位置缺失掉meq基因序列。体外实验证明缺失毒株与亲本毒株在CEF上具有相似的复制能力。本研究提供了一种简单、快捷的编辑MDV基因的方法，为MDV功能基因、分子进化和新型基因工程疫苗的研究提供了技术支持。 为了有效检测和监测MDV基因修饰株和MDV分离株，本研究基于meq基因缺失株rBS△Meq株和另一株rMS△Meq株建立了能分别定量区分MDV分离株与meq基因缺失株的荧光定量PCR方法，体外实验证实这些荧光定量PCR方法能分别准确定量meq基因缺失株和MDV分离株，检测灵敏度高、特异性好、稳定性高。这对于MD的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。 综上，本研究建立了一种利用CRISPR/Cas9系统编辑MDV分离毒株的方法，并利用该方法构建了一株MDV meq基因缺失毒rBS△Meq株，为新型基因缺失疫苗的研制和基因功能、分子进化研究提供了技术支持。同时，建立了区分MDV分离株和MDV meq基因缺失株的q-PCR方法，对研究MDV的感染进程、疫苗的免疫监控和MD的发生诊断有重要意义和应用价值。