基于EpC1和P--29抗原的绵羊棘球蚴病ELISA诊断方法建立

摘要

带科绦虫(Taeniidae)主要包含两个有效属，即带属（Taenia）(Linnaeus，1758)和棘球属（Echinococcus）(Rudolphi，1801)。因为在形态、发育特征和基因组成方面具有显着的相似性，因此棘球属绦虫是单源的(monophyletic)。棘球属至少包括9个种，而带属包括近50个种。棘球属绦虫是以食肉动物为终末宿主的小型肠道寄生虫。细粒棘球绦虫的中绦期幼虫引起囊型包虫病，其特征是在人类或其他中间宿主体内形成生长周期很长的包囊。囊型包虫病在全球范围内广泛分布，在广大牧区仍然高度流行。囊型包虫病CE被列为人类最严重的寄生虫病之一，是世界卫生组织(WHO)优先报告的17种被忽视的热带病之一。大量报道显示，因该病可造成巨大经济损失，威胁人类健康，人类也在努力尝试通过阻断虫卵从狗传播给人类或食草动物从而破坏其生活史循环。此外，带属的泡状带绦虫也是以犬等犬科动物作为最终宿主，而其幼虫阶段感染动物非常广泛，包括家畜、如山羊、绵羊和猪。由于囊尾蚴病造成了很大的兽医和经济损失，因此，与其他绦虫（如棘球属绦虫）一样，已有研究发现带属绦虫也存在种内变异。在非洲，很少有关于泡状带绦虫的流行病学和分布的研究，而种群之间遗传变异的研究报更少。 使用纯化的寄生虫分泌代谢物和重组蛋白构建的酶联免疫吸附试验(ELISA)是检测人和动物棘球蚴病的最可靠的方法。为了克服细粒棘球绦虫的粗提抗原或部分纯化抗原的交叉反应性问题，一些重组蛋白得到表达并评价了其作为诊断靶标的价值。本研究，使用重组蛋白EgEpC1和EgP-29作为包被蛋白来检测绵羊棘球蚴病的感染。基于NCBI中的核苷酸序列设计引物，然后分别用总RNA的RT-PCR扩增这两个蛋白编码基因的开放阅读框(ORF)。构建原核表达质粒pET-30a，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导细菌培养6h后表达目的蛋白。通过Ni螯合亲和层析纯化重组EpC1和P-29蛋白，然后用于构建间接ELISA方法，再通过绵羊棘球蚴病阳性血清和阴性血清样品评估。 此外，为了研究泡状带绦虫物种的遗传变异规律，收集了苏丹的11株绵羊来源细颈囊尾蚴囊尾蚴样品，基于NADH脱氢酶亚基1线粒体基因(nad1)序列进行分析。 利用两个重组蛋白建立的间接ELISA方法的敏感性和特异性分别为64.7％、69.04％(EpC1)，28.67％、51.16％（P-29）。另外，11个细颈囊尾蚴分离株的nad1基因与GenBank数据库中的基因的相似性为99％。nad1核苷酸序列(764bp)的序列比对显示有4个突变位点。单倍型多样性为0.345±0.172，而核苷酸多样性(π)为0.00114±0.00059。研究发现3个单倍型，占整个种群单倍体数的81.8％。与其他国家分离株相比，苏丹泡状带绦虫的幼虫分离株具有不同的单倍型。 本研究评估了两种抗原（EpC1和P-29）检测绵羊棘球蚴病的能力。由于有关于非洲泡状带绦虫遗传变异的研究很少，本研究首次对苏丹细颈囊尾蚴进行了分子鉴定和遗传变异分析，为未来苏丹泡状带绦虫种群的分子进化研究提供了有用的数据。