小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻保存技术的研究

摘要

该试验以毒性低、渗透性较强的乙二醇和DMSO为主体,添加聚蔗糖、蔗糖配制的玻璃化溶液(EFS30、EFS40、EDFS30和EDFS40),在室温(20℃和25℃)下利用细管法,以及在25℃和37℃恒温台条件下OPS法对小鼠2-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存,并对解冻后胚胎的体外培养、囊胚细胞计数及胚胎移植技术进行了研究.抗冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎的毒性试验表明,25℃室温条件下胚胎在PBS液中平衡20min经培养囊胚发育率为70.73﹪、在0.5mol/L的蔗糖液中平衡5~20min经培养囊胚发育率为65.71﹪~58.33﹪、在FS液中平衡5~20min、在10﹪EG和10﹪E+10﹪D溶液中平衡5~20min经培养囊胚发育率为61.54﹪~57.14﹪,表明这些物质对胚胎发育均几乎无影响.小鼠2-细胞胚胎在玻璃化溶液(EFS、EDFS)中平衡0.5min,其囊胚发育率为61.53﹪~62.50﹪;平衡时间为1min,囊胚发育率为60.00﹪~60.42﹪;平衡时间为2min,囊胚发育率为56.25﹪~61.70﹪;平衡5min,其囊胚发育率为47.5﹪~59.09﹪;平衡时间延长到10~20min,囊胚发育率下降到47.62﹪~0﹪.小鼠2-细胞细管法和OPS法玻璃化冷冻保存试验表明:在20℃室温条件下,用EFS40平衡1min细管一步法冷冻·解冻后,经培养其囊胚发育率仅为35.00﹪,和新鲜2-细胞胚胎体外培养的对照组(65.00﹪)的差异极显著(P<0.01).当2-细胞胚胎在10﹪E+10﹪D溶液中预处理5min,再移入EDFS中平衡30s二步法冷冻保存,解冻后囊胚发育率达47.72﹪~48.78﹪;当室温升至25℃时,二步法冷冻保存后2-细胞的囊胚发育率达到52.17﹪,与对照组无显著差异(P>0.05).改用OPS二步法EFS30冷冻组保存后的2-细胞胚胎的囊胚发育率高达62.22﹪,为试验中的最佳组.用细管法和OPS法最佳冷冻组胚胎解冻后培养至桑椹胚移植给受体母鼠均获得产仔.在25℃温度条件下细管法和OPS二步法玻璃化冷冻后的小鼠2-细胞胚胎,经培养发育至囊胚后,用H33342染色,在荧光显微镜下观察并进行细胞计数.结果表明:细管法和OPS法玻璃化冷冻组的囊胚细胞数(47.25±6.81;55.42±8.96)与鲜胚的囊胚细胞数(67.43±9.05)相比差异不显著(P>0.05).

目录

文摘

英文文摘

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略语表

第一部分文献综述

综述一哺乳动物胚胎冷冻保存技术研究进展

一、胚胎冷冻保存技术的发展概要

二、胚胎冷冻保存原理

三、抗冻保护剂

四、冷冻导致的胚胎损伤

五、胚胎冷冻保存技术前景

综述二小鼠胚胎玻璃化冷冻保存技术研究进展

一、玻璃化冷冻保存发展简史

二、几种常用玻璃化溶液的组成

三、抗冻保护剂对小鼠胚胎的毒性和渗透性

四、胚胎在玻璃化溶液中处理过程

五、小鼠胚胎玻璃化冷冻保存方法

六、小鼠胚胎玻璃化冷冻保存技术展望

第二部分研究论文

试验一抗冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎的毒性试验

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

试验二小鼠2-细胞胚胎细管法和OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

试验三玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎解冻后发育至囊胚的细胞计数

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

图版与说明

致谢