鸡传染性法氏囊病病毒地方株基因变异分析及防制研究

摘要

为探究近年来IBD呈现新特点的原因,澄清10年来洛阳地区IBDV基因是否发生了变异及变异的程度,以更好地作好该地区IBD的防制工作,该研究从以下几个方面进行了IBDV的基因变异分析及防制技术研究:1、对收集于洛阳地区1991年和2001年、前后间隔达10年之久的两个时期的8份IBD病料进行了病毒的分离鉴定、VP<,2>基因的克隆与序列分析.结果发现,8个地方流行株虽均属于IBDV超强毒株,但各个毒株间也有一定的差异.根据它们的核苷酸和氨基酸同源性高低可明显分为三群,分别位于系统进化树上超强毒区的三个小分支上.第一群包括1991年分离的L912、L914和L916三株;第二群包括L913、L017和L018三株;第三群包括2001年分离的L015和L016二株.群内各毒株间同源性较高,在98.3﹪-100﹪之间;群间各毒株的同源性则相对较低,在95﹪-97.9﹪之间,其中最低的为L015和L017、L016和L018二对,同源性均只有95﹪.进一步的序列分析表明,8个地方分离株均具有vvIBDV所具有的特征.其中,1991年分离的4株在各亲水区和七肽区的氨基酸和经典株及传统的超强毒株相比均无明显的变化;而2001年的4个分离株虽仍符合超强毒株的特点,但在相应亲水区均有1-2个氨基酸发生替换,特别是L015和L016株还出现了4个包括10个参考毒株在内的其它各毒株均没有的氨基酸位点变化.2、在以上工作的基础上,筛选了二株地方代表株分别制备了囊毒和胚毒二价灭活油乳苗,并分别检测、比较了其免疫效果.结果表明,所制备的囊毒灭活苗免疫效果显著优于胚毒灭活苗和活疫苗,在接种后的各个时期(除第10天外)所产生的AGP抗体效价均显著高于其它二种疫苗免疫鸡(P<0.01),最高AGP效价可达4.8log2,至接种后第90天时,仍具有1.8log2的AGP抗体效价;胚毒苗免疫效果虽然差于囊毒苗,但明显优于活疫苗,其最高AGP效价可达3log2,当活苗免疫组鸡血清中已无可测性抗体时,胚苗组仍具有1.0log2的AGP效价.在接种后第60天时分别应用IBDV标准毒、地方超强毒L015和L017所进行的攻毒试验中,囊苗免疫组鸡均100﹪地获得了保护;胚苗组鸡对这三种强毒株的攻击,也均可获得80﹪的保护,二种由地方毒株所制备的疫苗均未呈现出对不同毒株抵抗性的不同;而活疫苗组在攻毒试验中,对不同毒株的攻击保护率均较低,分别只有53.3﹪、40﹪和46.7﹪,呈现出了一定的差异性;在大田试验中,所制备的地方株囊毒和胚毒灭活油乳苗与其它活苗联合应用,保护率分别可达100﹪和98﹪以上.3、该研究在国内首次从新城疫Ⅰ系病毒接种的鸡胚脾细胞中扩增出了鸡IL-18全基因,并进行了序列测定.在此基础上,利用上游引物设计的HindⅢ酶切位点和pMD18-T载体上的Xba 1酶切位点,将鸡IL-18基因定向克隆至pcDNA3载体的相应位点,从而构建了鸡IL-18基因真核表达载体,并首次将其应用于IBD的防制中,观察了其对IBD胚毒灭活苗的免疫增强效果.结果表明,同接种IL-18真核表达质粒与IBD灭活苗的试验鸡所产生的中和抗体效价虽然在接种后的前21天内与单纯疫苗组相比无明显差异(P>0.05),但在接种第28天后,二组中和抗体效价均呈现了明显差异(P<0.05);其T、B淋巴细胞的增殖反应也基本上强于单纯疫苗组,尤其是T淋巴细胞的增殖反应从接种后第21天开始即明显强于单纯疫苗接种组(P<0.05);接种后第42天时进行的攻毒试验结果表明,同时接种IL-18表达质粒的试验组鸡获得93.7﹪的保护,而单纯疫苗接种组的保护率只有86.7﹪.足以证明,鸡IL-18真核表达质粒在鸡体内得到了良好表达,表达产物不但具有明显的增强IBD灭活疫苗诱导细胞免疫的作用,同时,对于中和抗体水平的提高、B淋巴细胞增殖反应的加强也具有一定的作用,从而提高了IBD胚毒灭活油乳苗的免疫效果.

目录

文摘

英文文摘

前言

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

1、传染性法氏囊病病毒分子生物学研究进展

1.1 IBDV的一般生物学特性

1.2 IBDV的基因组结构

1.3 IBDV的病毒蛋白

1.4 IBDV抗原与毒力变异的分子机制

1.5 IBD新型疫苗的研究

2、白细胞介素-18的生物学特性及研究进展

2.1不同动物IL-18的分子结构

2.2 IL-18的表达调控

2.3 IL-18的受体

2.4 IL-18的生物学功能

2.5 IL-18对NK细胞的调节作用

3、结语

第二章传染性法氏囊病病毒地方株的分离鉴定及致病特性研究

1、材料与方法

2、结果

3、讨论与小结

第三章传染性法氏囊病病毒地方株VP2基因的克隆和变异分析

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

第四章IBDV地方株囊毒二价灭活油乳苗的研制及免疫效果测定

1、材料与方法

2、结果

3、讨论与小结

第五章IBDV地方株胚毒二价灭活油乳苗的研制及与其它IBD疫苗免疫效果的比较

1、材料与方法

2、结果

3、讨论与小结

第六章鸡胚脾细胞白介素-18基因克隆与序列分析

1、材料与方法

2、结果

3、讨论与分析

第七章鸡IL-18真核表达载体的构建及其对IBD胚毒灭活疫苗免疫增强作用的研究

1、材料与方法

2、结果

3、讨论与分析

第八章结论

参考文献

致谢

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