导入高赖氨酸蛋白质基因改良水稻种子的营养品质

摘要

根据水稻谷蛋白(GluB-1,GeneBank序号X54314)基因的序列,设计了l对引物,利用PCR方法扩增出水稻谷蛋白(GluB-1)基因的启动子序列.分别利用能够在种子中特异性表达的水稻谷蛋白启动子和玉米醇溶蛋白启动子、高赖氨酸蛋白质基因cDNA和筛选基因nptⅡ基因构建了农杆菌转化用表达载体pCGK和pCl9ZK.利用能够在种子中特异性表达的玉米醇溶蛋白启动子、高赖氨酸蛋白质基因cDNA、筛选基因bar基因和核骨架结合序列(MAR)构建了基因枪转化用表达载体p19ZKBAR和p19ZKMAR,表达载体p19ZKMAR与表达载体p19ZKBAR结构的不同之处是载体p19ZKMAR的目的基因两端连接有核骨架结合序列(MAR).用农杆菌介导法分别将植物表达载体pCl9ZK和pCGK导入水稻品种龙特甫B的成熟胚诱导的愈伤组织中.获得再生植株178株.PCR和Southern blot检测表明,转化表达载体pCl9ZK获得转基因植株24株,转化表达载体pCGK获得转基因植株l株.用基因枪轰击法将植物表达载体p19ZKBAR和p19ZKMAR导入龙特甫B的成熟胚诱导的愈伤组织和中优早5号的幼胚中.共获得再生植株64株,PCR检测16株呈阳性(龙特甫B 5株,中优早5号1l株),其中转化表达载体p19ZKMAR未获得转基因植株.用叶片涂抹除草剂法检测了Tl代转基因植株中外源基因在转基因植株后代中的表达和分离情况,检测了15个株系群体共160株,抗性植株有8l株(龙特甫B 19株,中优早5号62株),各个株系中抗性苗的比例(25﹪~80﹪)不同.Southern blot检测30株呈阳性(龙特甫B 7株,中优早5号23株).Western-blot分析了12株转基因成熟种子中蛋白质的积累情况,结果表明高赖氨酸蛋白质基因在水稻中得到了表达,在50 ku处出现了与对照位置一致的条带.对基因枪转化表达载体p19ZKBAR产生的部分Tl代转基因植株成熟种子进行的分析结果表明,中优早5号转基因种子中蛋白质含量(12.07﹪~16.20﹪)平均提高了35.18﹪,蛋白质中赖氨酸的含量(4.02﹪~4.35﹪)平均提高了7.42﹪,龙特甫B转基因种子中蛋白质含量(11.92﹪~12.87﹪)平均提高了27.69﹪,种子干重中赖氨酸的含量(0.51﹪~0.57﹪)平均提高了16.15﹪.对用农杆菌介导法转化pCl9ZK产生的部分T0代龙特甫B转基因植株成熟种子的分析结果表明,种子中蛋白质含量(10.87﹪~13.16﹪)平均提高了22.03﹪,种子干重中赖氨酸的含量(0.47﹪~0.60﹪)平均提高了14.01﹪.

目录

文摘

英文文摘

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缩略词

第一章文献综述

1水稻胚乳储藏蛋白的组成、分布和营养

2水稻营养品质改良的途径和研究进展

3转化方法

4筛选体系

5水稻营养品质改良中常用的标记基因的安全性

6转基因水稻中标记基因的消除策略

7植物表达载体的改进和优化

8.结束语

第二章选题意义

第三章实验材料与方法

1实验材料

2常用培养基和溶液的配制

3实验所需试剂及其配制

4基本实验方法

第四章结果与分析

1 PCR方法扩增水稻谷蛋白启动子

2植物表达载体的构建

3水稻转化体系的优化

4抗性愈伤的获得及植株分化、再生

5农杆菌法转化获得的T0代植株的分子检测

6基因枪法转化获得植株的分子检测

7转基因植株种子的蛋白质和赖氨酸含量

第五章讨论与结论

1讨论

2结论

参考文献

致谢