鸭、鹅、鸸鹋生长素前体cDNA克隆、定位、组织表达及分子进化研究

摘要

ghrelin是促生长激素分泌受体的天然配体,全长28个氨基酸残基的多肽.具有刺激垂体生长激素分泌的重要作用,其第3位丝氨酸残基为辛酰基化修饰,其前体preproghrelin为全长117个氨基酸残基的多肽.根据鸡preproghrelin的cDNA序列(dEST accession no.AB075215,836bp)设计引物,以鸭、鹅、鸸鹋腺胃cDNA为模板,通过RT-PCR及3'-RACE的方法,将各个产物经过回收,再经连接转化,克隆测序,拼接后得到鸭、鹅、鸸鹋preproghrelin基因的cDNA序列及ghrelin的cDNA序列,并由此推测出preproghrelin及ghrelin的氨基酸序列.系统进化分析表明,鸭preproghrelin氨基酸序列与鹅preproghrelin的氨基酸序列最先聚类合并,在进化上显示靠得最近,然后与鸸鹋,鸡和火鸡preproghrelin氨基酸序列聚类合并,接着与牛蛙、各种鱼类聚合,然后再与牛、羊等聚合.符合按照形态特征进行判定的系统进化关系.根据鸡preproghrelin的基因组序列(accession no AY303688.)设计引物,通过筛选实验室已有的丝毛乌骨鸡BAC文库,继而得到含鸡preproghrelin的BAC克隆,将其作为探针进行标记,用FISH方法将鸡的preproghrelin定位在GGA2q.1.1.根据鸡GAPDH的cDNA序列(dEST accession no.K01458,1284bp)设计引物,以其PCR产物作为内标,分别以鸸鹋各个组织反转录产物为模板,通过多重PCR的检测ghrelin的mRNA在鸸鹋的各个组织中表达情况,结果发现ghrelin的mRNA在鸸鹋ghrelin的mRNA除在腺胃特异表达外,在肺、肌肉、回肠、十二指肠、纹状体、小脑、脑干、肌胃也有少量表达.

目录

文摘

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缩略词表

第一章文献综述

1.1生长激素分泌的调节

1.1.1生长激素的结构与功能

1.1.2生长激素分泌的激素控制

1.2 Ghrelin基因的研究进展

1.2.1 Ghrelin的发现

1.2.2 Ghrelin的结构及分布

1.2.3 Ghrelin的受体及分布

1.2.4 Ghrelin的功能

1.2.5 Ghrelin分泌的调节

l.3荧光原位杂交(FISH)及其衍生技术

1.3.1 FISH探针类型：

1.3.2探针的标记方法：

1.3.3 FISH衍生技术及其应用

1.3.4杂交特异性

1.3.5检测灵敏度

1.3.6展望

1.4研究意义及实验方案：

1.4.1研究意义

1.4.2可行性分析

1.4.3实验方案

第二章鸭、鹅、鸸鹋preproghrelin的cDNA克隆及进化分析

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1.实验材料

2.2.2.主要实验方法

2.3结果与分析

2.3.1 Ghrelin1引物扩增、测序结果

2.3.2 Ghrelin2引物扩增、测序结果

2.3.3 3’-RACE扩增、测序结果

2.3.4鸭、鹅、鸸鹋preproghrelin及ghrelin的序列分析

2.3.5鸭、鹅、鸸鹋preproghrelin及ghrelin与鸡同源性比较

2.3.6鹅、鸸鹋preproghrelin及ghrelin氨基酸序列预测

2.3.7鸭、鹅、鸸鹋preproghrelin及ghrelin氨基酸序列与鸡同源性比较

2.3.8根据preproghrelin的氨基酸序列进行种系发生分析

2.4小结与讨论

2.4.1鸭、鹅、鸸鹋Ghrelin基因克隆测序分析

2.4.2鸡、鸭、鹅、鸸鹋preproghrelin及ghrelin同源性比较

2.4.3 Preproghrelin进化分析

2.4.4关于3’RACE

第三章鸡Ghrelin基因的物理定位

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2主要实验方法：

3.3结果与分析

3.3.1 Superpool筛选结果：

3.3.2次级库筛选结果：

3.3.3 BAC的鉴定：

3.3.4 FISH定位结果：

3.4讨论

3.4.1 BAC库的筛选

3.4.2 FISH定位图中的杂信号分析

第四章鸸鹋Ghrelin基因mRNA组织表达谱

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1.实验材料

4.2.2主要实验方法

4.3实验结果

4.3.1鸸鹋组织RNA的初浓度及稀释倍数

4.3.2鸸鹋组织中preproghrelin的mRNA表达情况

4.4讨论

4.4.1多重PCR分析组织基因表达

4.4.2半定量PCR分析组织基因表达

4.4.3多重PCR循环数的探索

4.4.4鸸鹋ghrelin的mRNA在各个组织中表达分析

第五章结论

主要参考文献

附录

致谢