小麦白粉菌交配型和白化性状的分子标记及其与小麦互作基因初步研究

摘要

对影响RAPD扩增图谱的5个因子:Primer浓度、模板浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量和Mg<'2+>浓度设计了5个水平,再通过正交分析表组建了25个反应体系,然后根据可辨识的电泳条带进行正交实验表中各组结果的统计,建立起小麦白粉病菌的RAPD分析优化体系.结果表明:在试验范围内,5个因子中对扩增结果的影响由大到小依次为Primer浓度、模板浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量和Mg<'2+>浓度.在反应体系中,各项因子最适浓度为:引物浓度2.0μmol/L,模板浓度5ng,dNTPs浓度0.1 mmol/L、Taq酶用量1.5U,Mg<'2+>浓度2.0mmol/L.在所得的RAPD优化体系的基础上,采用集群分析法(BSA),分别对小麦白粉菌交配型和白化性状进行了多态性分析.结果表明,在520条随机引物中有478条单引物能扩增出条带,占扩增引物总数的92﹪,扩增片段在300-2000bp之间.对交配型性状,有24个引物或引物组合在DNA池中扩出多态性条带;对白化性状,有15个引物扩出多态性条带,但只有两个RAPD标记,OPQ03<,775>和OPQ09<,685>可能分别与交配型和白化性状相关.将这两个RAPD标记片段克隆,序列分析显示:这两段序列与目前已知的任何序列都没有同源性,且只有OPQ03<,775>有较长的开放式阅读框架.根据克隆片段末端序列设计引物,成功的将RAPD标记转化为更为稳定的SCAR标记.标记OPQ03<,775>能在7个已知交配型菌株中扩增出特异性条带,在由34个野生菌组成的菌群中的出现与否符合1:1的比例,跟交配型分布的理论值一致;标记OPQ09<,685>在白化和正常菌株的43个杂交后代中与白化性状的交换率是25.6﹪,经软件MAP AKER3.0计算,遗传距离为15.2cM,表明该标记与白化性状有一定的连锁性.从大麦白粉菌已克隆的174个基因中调出20个与大麦互作的基因,并从中选取了4个基因:BIG2,大麦诱导表达基因,在侵染初期起调控作用;Cat1,过氧化氢酶基因;CLg,与大麦白粉菌的毒力,侵染及附着胞形成相关;gp16,大麦白粉菌萌发蛋白基因.根据基因序列设计特异性引物对小麦白粉菌基因组扩增,只有引物对Cat1p扩出特异性条带.将该片断回收克隆测序,序列分析显示该片段全长669bp,编码172个氨基酸,与大麦白粉菌的相应片段的序列相似性为93﹪,该区域位于过氧化氢酶功能域编码区.

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Abbreviation

第一章绪论

1.1 DNA分子标记技术及其在真菌交配型和白化性状研究中的应用

1.1.1 DNA分子标记的主要类别

1.1.2几种常见DNA分子标记技术的比较

1.1.3真菌交配型性状分子标记

1.1.4真菌白化性状分子标记

1.2禾谷类白粉菌与寄主互作功能基因

1.3本研究的目的和意义

第二章交配型与白化性状分子标记

2.1交配型与白化性状RAPD分子标记

2.1.1材料

2.1.2方法

2.1.3结果与分析

2.2 RAPD标记的克隆及SCAR转化

2.2.1材料

2.2.2方法

2.2.3结果

2.3交配型性状其它分子标记

2.3.1供试菌株

2.3.2根据大麦白粉菌交配型相关EST设计特异性引物扩增

2.3.3利用子囊菌交配型基因HMG编码区的简并引物扩增

2.4讨论

第三章小麦白粉菌与小麦互作基因的检测

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2菌株分生孢子的收集和基因组DNA的提取

3.1.3互作基因的选择与引物设计

3.1.4 PCR产物的克隆及鉴定

3.1.5序列测定及序列分析

3.2结果与分析

3.2.1引物设计结果

3.2.2 PCR产物的扩增

3.2.3 PCR产物的序列测定结果与分析

3.3讨论

第四章结论

4.1 RAPD反应的优化

4.2目的性状分子标记

4.3互作基因检测

参考文献

致谢

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附图

附表